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ICS：65.020B61备案号：甘肃省地方标准DB62/T1703—2009马铃薯种薯茎尖脱毒和组培苗繁育技术规程2009—04—20发布2009—05—15实施甘肃省质量技术监督局发布DB62DB62/T1703—2009-2-前言本标准由甘肃省农牧厅提出。本标准起草单位：甘肃省种子管理总站、定西市旱作农业科研推广中心、甘肃省农科院马铃薯研究所。本标准主要起草人：常宏、第红君、蒲育林、王一航、戴铮、王瑞英、杨培达、齐恩芳DB62/T1703—2009-3-马铃薯种薯茎尖脱毒和组培苗繁育技术规程1范围本标准规定了马铃薯种薯的定义、有害生物、生产体系、质量要求、茎尖脱毒流程和组培苗繁育技术要求。本标准适用于马铃薯种薯茎尖脱毒和组培苗的生产。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB7331马铃薯种薯产地检疫规程GB18133马铃薯脱毒种薯NY/T1212—2006马铃薯脱毒种薯繁育技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1马铃薯种薯符合GB18133规定相应质量要求的原原种、原种和大田用种。3.2组培苗马铃薯优良品种的块茎，经茎尖剥离病毒、组织培养获得的，经质量检测后不带有PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、PVM和马铃薯纺锤块茎类病毒，用于生产原原种或原种的再生苗。3.3原原种pre-elite用育种家种子、脱毒组培苗或试管薯，在防虫网、温室等隔离条件下生产，经质量检测达到GB18133要求的马铃薯种薯。3.4原种elite用原原种作种薯，在良好隔离环境中生产的，经质量检测达到GB18133要求的种薯。3.5一级种薯（大田用种）qualifiedⅠ在相对隔离环境中，由原种作种薯生产的，经质量检测后达到GB18133要求的，用于生产二级种薯或商品薯的种薯。3.6二级种薯（大田用种）qualifiedⅡ在相对隔离环境中，由一级种薯作种薯生产的，经质量检测后达到GB18133要求的，用于生产DB62/T1703—2009-4-商品薯的种薯。3.7外部缺陷畸形、次生、龟裂、虫害和机械损伤的薯块。4有害生物4.1非检疫性限定有害生物4.1.1病毒马铃薯X病毒马铃薯Y病毒马铃薯A病毒马铃薯S病毒马铃薯M病毒马铃薯卷叶病毒4.1.2细菌马铃薯青枯病菌马铃薯湿腐病马铃薯软腐病马铃薯黑胫病菌4.1.3放线菌马铃薯普通疮痂病4.1.4真菌马铃薯晚疫病马铃薯干腐病马铃薯黑痣病4.1.5虫马铃薯块茎蛾4.2检疫性有害生物4.2.1类病毒马铃薯纺锤块类病毒4.2.2细菌马铃薯环腐病菌4.2.3植原体马铃薯丛枝植原体4.2.4线虫马铃薯白线虫马铃薯金线虫4.2.5虫马铃薯甲虫DB62/T1703—2009-5-5种薯生产体系种薯生产体系包括两个阶段：即在设施条件下生产组培苗、原原种和在田间自然条件下生产原种、一级种薯和二级种薯。种薯（苗）的质量检验将针对上述两个阶段不同环节产出的产品进行。种薯生产体系流程见图1。图1种薯生产体系流程图6质量要求6.1种薯分级种薯级别分为原原种、原种、一级种薯和二级种薯。6.2质量要求种薯生产产地检疫应符合GB7331规定。一旦发现检疫性病虫害，应立即向检疫部门报告，并由其根据病虫害种类采取相应措施。同时该地块所有马铃薯不能作为种薯。组培苗经质量检测后不带有PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、PVM和马铃薯纺锤块茎类病毒。7脱毒流程7.1培养基制备7.1.1培养基分装：培养基分装于器皿中。7.1.2消毒：器皿置于0.8kg/cm2～1.1kg/cm2消毒锅120℃高压灭菌20min。7.2材料的选择和处理7.2.1取材于经审（认）定品种的健康腋芽或休眠芽。7.2.2在生长季节选择具有原品种典型特征的单株材料，收获并通过休眠后，将薯块在温室或培养箱内进行催芽处理。组培苗原原种原种一级种薯二级种薯DB62/T1703—2009-6-7.3茎尖脱毒7.3.1无菌工作条件：组培室用甲醛溶液熏蒸后，用紫外线灯照射40min。工作人员用肥皂水洗手，75%酒精擦拭消毒，操作用具置烘箱180℃消毒。7.3.2病毒钝化：将马铃薯薯块在36℃条件下处理4～6周后制取脱毒材料，用紫外线照射脱毒材料10min，或在培养基中加入病毒唑，使病毒失活钝化。7.3.3茎尖消毒：待芽萌发至2cm～3cm时，选取粗壮的芽，用解剖刀切下，芽段用无菌水冲洗20min，再用75%的酒精浸蘸一下，放入无菌杯内用0.1%的Hgcl水浸泡5min或10％的次氯酸钠浸泡15min，用无菌水冲洗2～3次。7.3.4茎尖剥离及接种：将茎尖放在无菌滤纸上吸干水分，在30～40倍解剖镜下用解剖刀、解剖针剥取带一个叶原基的茎尖（0.2mm～0.4mm），将生长点迅速按无菌操作程序接入培养基中。7.4组培苗培养7.4.1温度15℃～25℃，光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间16h/d，培养120d～140d。7.4.2当看到明显生长的小茎，叶原基形成可见的小叶，转入无生长调节剂的培养基中。7.4.3小苗继续生长并形成根系，发育成3～4个叶片的小植株，就可继续扩繁。7.4.4病毒检测：以单株为系进行扩繁，苗数达150～200株时，随机抽取3～4个样本，每个样本10～15株，进行病毒检测，采用GB18133附录A：酶联免疫吸附试验法和附录B：往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法确认不带有PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、PVM和马铃薯纺锤块茎类病毒。8组培苗的繁育8.1组培苗的繁育8.1.1培养基制备：将MS培养基配制成液，装入器皿（MS培养基配方见NY/T1212—2006附录L表L.1），置于0.8kg/cm2～1.1kg/cm2消毒锅120℃高压灭菌20min。8.1.2组培苗处理：将组培苗置于超净工作台上，器皿表面用75%的酒精擦试消毒，取出组培苗，按单茎切段，每个段带一片小叶摆放在培养基面上。8.1.3组培苗培养条件：温度15℃～25℃，光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间16h/d。8.2组培苗的快速繁育8.2.1基础苗繁育8.2.1.1按8.1.1、8.1.2配制培养基和处理组培苗。8.2.1.2切段底部（根部）不作为基础苗，直接转入移栽用苗培养。其他各段作为基础苗进行繁殖。8.2.1.3培养温度15℃～20℃，光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间10h/d～14h/d。8.2.1.4培养周期30d～40d。8.2.2移栽用苗的繁育8.2.2.1按8.1.1、8.1.2配制培养基和处理组培苗。8.2.2.2培养温度15℃～25℃，光照强度3000Lx～4000Lx，光照时间14h/d～16h/d，采用自然光照培养室进行培养。8.2.2.3培养周期15d～20d，苗长出5叶、5cm以上即可移栽。DB62/T1703—20097