有机酸发酵工艺

张海龙山东教育学院生物系ShanDongInstituteofEducation有机酸发酵工艺有机酸发酵工艺有机酸发酵工艺有机酸发酵工艺第一章、柠檬酸•一、简介–学名：3－羟基－3－羧基戊二酸–是生物体主要代谢产物之一，在自然界分布广泛。•主要存在于植物的果实中，尤其以未成熟者含酸量较多。•在动物中，柠檬酸存在于骨骼、肌肉、血液、乳汁、唾液、汗、尿中，或者以游离态或金属盐的形式存在。–主要以发酵法生产。第一节、概述COOHCHCOOHCHHOCOOHCH22－—－－二、柠檬酸行业现状•我国是世界第一生产和出口大国。–1.总产量稳定增加，品种不断延伸，集约化程度大幅提高。–2.技术水平不断提高，消耗一降再降，生产成本压缩到新的水平。–3.产品品质越来越好。–4.新技术、新材料、新设备的应用有了很多新的收获。•柠檬酸行业亟待解决的课题：–1.全面提升产品质量，仍为当务之急。–2.打造中国的知名品牌。–3.继续致力于生产技术的提高与创新。–4.应用领域的拓宽和系列产品的延伸。三、柠檬酸类产品的应用•1、在食品工业的应用–饮料、果酱与果冻、酿造酒、冰淇淋和人造奶油、腌制品、罐头食品、豆制品及调味品、烟草。•2、在医药上的应用–柠檬酸盐用于补充相应的元素时，具有溶解度高，生理宽容度大，酸根直接被吸收代谢而无积留的优点。–柠檬酸糖浆、柠檬酸铁铵、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸铜、柠檬酸镁等。•3、在化学工业的应用–柠檬酸及其盐类和衍生物在化学工业中广泛用作缓冲剂、催化剂、激活剂、增塑剂、螯合剂、清洗剂、吸附剂、稳定剂、消泡剂等。•4、其他应用四、发酵机制•1、柠檬酸合成酶•2、顺乌头酸酶•3、丙酮酸酸化酶•3`、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶OHOHCOOH2786261264232C+→+柠檬酸积累机理•1、黑曲霉在缺锰培养基中，可提高浓度，高浓度的可使柠檬酸磷酸果糖激酶（PFK)的抑制作用的解除。•2、由组成性的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。•3、控制含量，顺乌头酸水合酶活性低，从而使柠檬酸积累。•4、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰ＣoA和CO2固定反应两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。•5、柠檬酸积累增多，pH低，在低pH时，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，进一步促进了柠檬酸的积累。+4NH+4NH+2Fe7390：：柠檬酸＝柠檬酸：顺乌头酸：异平衡时第二节、柠檬酸发酵微生物及扩大培养•生产菌种：黑曲霉黑曲霉黑曲霉黑曲霉、酵母（解脂假丝酵母、季也蒙毕赤酵母）。•黑曲霉：–属于半知菌纲，一般只进行无性繁殖。由孢子发芽开始到孢子形成成熟为一个生活周期。–在察氏琼脂上长成局限菌落，室温（24～26度）下培养10～14天直径达2.5～3cm，由致密防中度疏松的白色防微黄色基本菌系组成，菌落大部分在培养基内，着生丰富密集的直立分生孢子梗。菌落典型为碳黑色，但有时也为深褐黑色；反面通常无色，偶尔中心甚至全部呈淡黄色。有霉味，不典型。分泌物无，或局限为微小液滴，无色。一、生产菌种二、菌种的扩大培养•目的：获取大量高质量的分生孢子（孢子或干孢子），所以又称为“干孢子生产”。•对孢子的质量要求：–形态整齐均一，无杂菌混入，发芽率高，发芽后生长速率适当，产酸活力高，无退化现象。•黑曲霉的扩大培养一般经过三个阶段，相应的阶段依次称为一级一级一级一级、二级二级二级二级、和三级三级三级三级种子培养。扩大培养的工艺流程和各级的培养方法因地而异，按照最终成品的形式可以区分为麸曲生产麸曲生产麸曲生产麸曲生产和孢子生产孢子生产孢子生产孢子生产。•麸曲生产工艺流程•孢子生产工艺流程麸曲茄子瓶斜面原种三级二级一级⎯⎯→⎯⎯⎯→⎯⎯⎯→⎯收集铝盆三角瓶斜面原种三级二级一级→⎯⎯→⎯⎯⎯→⎯⎯⎯→⎯也可用大量斜面培养•斜面培养斜面培养斜面培养斜面培养：–32度，用于菌种保藏的斜面培养3～4天，直接使用的培养5～6天。用于保藏的斜面只要一部分出现成熟的颜色即可，而直接使用的需要全部成熟，但不宜培养过度。•二级扩大培养二级扩大培养二级扩大培养二级扩大培养：–32度，液体表面培养液体表面培养液体表面培养液体表面培养7～10天，琼脂固体培养琼脂固体培养琼脂固体培养琼脂固体培养6～7天。培养时观察到整个表面孢子着色均匀，现出成熟特征的颜色即可。•三级扩大培养三级扩大培养三级扩大培养三级扩大培养：–液体表面培养要求在30～32度，室内相对湿度在70％以上。正常情况下，24h的菌盖占液面的1／3，白色，40h开始着生孢子，逐渐变黑，4～5天后孢子成熟。–麸曲培养时，温度30～32度，14～16h后，白色菌丝已盖满曲层表面，翻曲一次。再经6～8h，可见培养基再次结成块状，这时白色菌丝生长旺盛，但未见孢子，第二次翻曲。再经数小时后培养基重新结块时，应扣瓶，即翻转三角瓶使曲块凌空，在培养3～4天，使瓶内张满丰盛的孢子即可使用。–孢子收集：•采用按吸尘器原理专门设计的孢子收集器。第三节、柠檬酸发酵工艺–表面发酵–固体发酵–深层发酵利用气相中的氧利用溶解氧一、表面发酵•利用生长在液体表面的微生物之代谢作用，将可发酵性原料转化为柠檬酸。•特点：–优点：•设备简单，投资少，投产快。•操作技术简单，能耗低。•原料粗放，对糖蜜等原料也能适应，而且适于高浓度发酵，产酸浓度也高。–缺点：•表面发酵设备占地面积大，劳动强度高，发酵时间长，菌体生成量多而影响产酸率。（一）、表面发酵设备•1、发酵室–室温能在28～35度，相对湿度在75～80％范围内进行控制。–房屋必须采用保温建筑结构，以节约空调能耗和防止室内温度波动。–具有空调和无菌空气供给系统。最好有温度自动控制系统。•2、发酵盘发酵盘发酵盘发酵盘–常用铁盘、铝盘、耐酸塑料盘、不锈钢盘等，发酵盘经常受到酸液、高温蒸汽、甲醛、微生物的侵蚀，所以材料和涂料要求严格。–为了防止蒸发过快和天花板冷凝水滴入盘中，每个发酵盘上有一盘罩。•3、通风系统（喷雾器））置换法不置换法发酵（接种培养基制备培养室灭菌→→→（二）、发酵流程二、固体发酵工艺•固体发酵工艺是将发酵原料及菌体被吸附在疏松的固体支持物上，经过微生物的代谢活动，将原料中的可发酵成分转化为柠檬酸。•特点：–优点：•设备简单，投资少，可以因陋就简，利用原有任何发酵工业的固体发酵设备。•操作简单，能耗低，适应性强。•原料粗放，可利用很多其他发酵工艺无法利用的粮食加工下脚料或废料进行生产。•发酵周期短，一般只需2～3天。–缺点：•设备占地面积大，劳动强度大，传质传热困难，产率和回收率低，副产物多等。（一）、固体发酵设备•1、薄层发酵设备：–与表面发酵室类似。•2、厚层发酵设备–厚层通风制曲箱：•曲箱由假底隔为两层，上层深度为50～60cm，下层为20cm,箱底约1m，长度可以在很大范围内变化，单端通风一般不超过20cm，双端通风可达40cm。•苏联采用的厚层固体发酵罐•3、蒸料设备–蒸料的目的是是淀粉糊化，兼灭菌作用。（二）、发酵流程含氮辅料）（干料薯渣、）厚层通风发酵薄层发酵发酵（装盘进室补水接种摊冷蒸料薯渣醅的配料麸曲制备以下降到337CaCOC→→⎯⎯⎯⎯→⎯→→↓°添加碳酸钙，可以部分中和其酸度，从而解除了酸的抑制作用，有利于继续积累柠檬酸。三、深层发酵工艺•深层发酵是微生物均匀分散在液相中，利用溶解氧，发酵时不产生分生孢子，全部菌体细胞都参与合成柠檬酸的代谢。•特点：–发酵体系是均一的液体，传热传质良好，不存在死区。–设备占地面积小，生产规模大。–发酵速率高，采用预培养菌丝球接种时只需50～70h即发酵完成。–产酸率高，产柠檬酸几乎接近理论产率，菌体生成量少，从而原材料消耗低。–发酵设备密闭，杂菌污染的可能小，管理方便。–完全机械化操作，劳动强度低，劳动生产率高。–发酵副产物少，又易于产品提取，所得产品质量高。–技术水平要求高一、深层发酵工艺流程第四节、柠檬酸提取工艺•我国柠檬酸提取工艺（钙盐法）浓缩结晶离心干燥包装成品母液石膏渣废糖水菌体，残渣净化酸解，过滤中和、过滤过滤发酵液石灰乳、粗酸液钙盐←←←←←↓↓↓⎯⎯→⎯⎯⎯→⎯→→↓↓↓423SOHCaCO中和工艺流程净化工艺流程第二章、衣康酸•衣康酸及其酯类是制造合成树脂、合成纤维、塑料、橡胶、离子交换剂、表面活性剂和高分子螯合剂等的良好添加剂和单体材料。•衣康酸，又称甲叉琥珀酸，分解乌头酸，按分子结构应称甲叉丁二酸，亚甲基丁二酸.分子量：130.1，比重：1.49，溶于水、乙醇和丙酮，有一个不饱和双键与羟基呈共轭关系。化学性质活泼，能进行各种加成反应和聚合反应。•衣康酸二甲酯的结构式：CH2=C—COOCH3︳CH2—COOCH3精制衣康酸规格指标≤0.03%灼烧残渣≤0.3%干燥失重≤0.0001%锰含量≤0.0001%铜离子含量≤0.002%硫酸根含量≤0.001%氯化物含量≤0.0005%重金属≤0.0001%铁含量≤5色度165℃-168℃熔点≥99.6含量白色粉末或无色晶体外观标准项目•(1)作交联剂：衣康酸与苯乙烯共聚生产的塑料和涂料具有质轻、绝缘、防水、抗腐蚀、可塑性好等特点。用于填充玻璃纤维制成高强度玻璃钢，或作为地毯背面及纸面涂层。•（2）作合成纤维中间体：以衣康酸作第三单体生产的睛纶纤维具有手感好、易染色的优点。•（3）生产透明材料：衣康酸聚全物具有特殊的光泽、透明，适用于制造人造宝石和特种透镜。•（4）除垢剂原料：衣康酸和丙烯酸的共聚物是一种高分子螯合剂，用于锅炉、水冷却器等系统中作除垢剂，对防止碱性钙、镁垢的形成有特效•（5）粘结剂原料：用衣康酸生产的丙烯酸胶乳是非织造纤维的良好粘结剂。含衣康酸单体与聚氯乙烯粘结剂对纸张、赛璐珞有良好的粘结性。•（6）牙材粘合剂原料：衣康酸-丙烯酸与多价金属氧化物交联制成的牙科粘合剂具有良好的抗压性能和心理适应性能。•此外，衣康酸与胺生成的吡咯烷酮衍生物用于润滑剂、洗涤剂、医药和除草剂中，衣康酸及酯类是生产合成树脂、阳离子交换树酯、表面活性剂的良好添加剂，也是塑料的优良增塑剂。衣康酸还是生产柠康酸、中康酸、衣康酐、柠康酐等的原料。衣康酸的生物合成途径（两种认识）•Bentley等（1957年）认为，葡萄糖经EMP途经和三羧酸循环合成柠檬酸后，在脱水脱羧生产衣康酸。衣康酸乌头酸—顺柠檬酸葡萄糖－－——COOHCHCOOHCHCOOHCHCOOHCCOOHCCCHCHCOOHCOOHCH222COOH61262222⎯⎯→⎯⎯⎯→⎯−−→→COOHCHOOH对糖的转化率72％•Shimi等人认为，乙酸和琥珀酸现缩合成三羧酸，在脱氢脱羧，生成衣康酸。衣康酸乌头酸—顺三羧酸乙酸－－琥珀酸乙酸乙醇葡萄糖———COOHCHCOOHCHCOOHCHCOOHCHCOOHCCOOHCHCHCHCOOHCOOHCHCOOHCHCOOHCHCOOH3CHOHCH3CHOHC2112223CO2H2H2222323EMP61262⎯⎯→⎯⎯⎯→⎯−⎯⎯→⎯→→→⎯⎯→⎯COOHC对糖的转化率48％衣康酸发酵微生物（两种）•土曲霉：–菌落：在查氏培养基上在28～30°C培养10天，直径达3.5～5.0cm，而在麦芽汁平板上4～5天可布满直径9cm的培养皿。表面绒毛状或偶见絮状，平坦或有放射性皱纹，肉桂色至沙褐色，反面黄色至褐色。–分生孢子头：呈长而紧密的直柱状，老后可达150～500*30～50um。–分生孢子梗：较短，一般100～250*4.5～6um，弯曲，光滑，无色。–顶囊：半球形，10～16um。–小梗：双层，梗基平行，密集着生于顶囊上半部。–分生孢子：球形或近球形，直径1.8~2.4um，表面光滑。•衣康酸曲霉：–菌落：在查氏琼脂上呈绒状，厚1～2mm，白色或微黄色，起皱不规则，零散的生出绿色分生孢子头；明显的黄色渗出物。在麦芽汁琼脂上生长较快，产孢子也多。分生孢子头遍布在菌落上，但边缘区域更加浓密。菌落背面呈亮金黄色。–分生孢子头：球形，放射状。直径达500～600um。–分生孢子梗：光滑，无色，长达3～4mm。–顶囊：球形，直径15～70um，小梗着生于整个顶囊表面。–小