柴胡有效成分提取工艺研究

史上最快最全的网络稳定批量下载，尽在：=9176907081柴胡有效成分提取工艺研究肖功胜，王启帅,杨云*，（河南中医学院药学院，河南郑州450008）摘要：目的：确定柴胡有效成分提取的最佳工艺。方法：以柴胡中挥发油吸收度和柴胡皂苷a的含量为指标，采用单因素试验筛选主要因素和水平，再以正交试验筛选柴胡有效成分提取最佳工艺。结果：最佳工艺参数为40℃温浸，收集相当于药材2倍量蒸馏液，继用8倍量含5%氨水的95%乙醇回流1h提取柴胡皂苷，可使挥发油吸收度达0.941，柴胡皂苷a的含量达0.32%。结论：该工艺为柴胡有效成分的提取提供了可靠依据，且工艺条件稳定可靠，重复性好。关键词：提取工艺；柴胡皂苷a；挥发油；正交试验StudyonExtractionTechnologyofActiveIngredientsfromBupleurumchinenseDCXIAOGong-sheng,WANGQi-shuai,YANGYun*（CollegeofPharmacy,HenanUniversityoftraditionalChinesemedicine,Zhenzhou450008.China）ABSTRACTOBJECTIVETodeterminetheoptimumtechnologyofactiveingredientsfromBupleurumchinenseDC.METHODSWiththeabsorbanceofvolatileoilsandthecontentofinBupleurumchinenseDCasindexes,selectingthemajorinfluencingfactorsandlevelsbythesinglefactorexperiment,andselectingtheoptimumtechnologybyorthogonalexperiment.RESULTTheoptimumconditionshowstheimpregnatingtemperatureis40℃,thevolumeofdistilledfluidis2timesofweightofBupleurumchinenseDC,andthevolumeof95%alcoholwith5%ammoniawatertorefluxextractionfor1houris8timesofweightofBupleurumchinenseDC,thentheabsorbanceofvolatileoilsis0.941andthecontentofsaikosaponinais0.32%.CONCLUSIONTheoptimumtechnologyprovidesreliableevidenceforextractionofactiveingredientsfromBupuleurumchinenseDC,andtheconditionsareaccurateandreliablewithgoodreproducibility。KEYWORDS：Extractiontechnology;saikosaponina;volatileoils;orthogonalexperiment基金项目：国家十一五科技支撑计划资助项目（2006BAIO6A10）作者简介：肖功胜（1982—），男，湖南邵阳人，硕士研究生，从事天然药物化学研究。*通讯作者：杨云，女，硕士生导师，教授。Tel:0371—65680605E-mail:[e-mail]柴胡为伞形科植物柴胡（BupleurumchinenseDC）或狭叶柴胡（BupleurumscorzonerifoliumWild）的干燥根[1]。具有疏散退热，疏肝解郁，升阳举陷之功效，为中医治疗少阳症的首选要药。其主要化学成分为柴胡皂苷和挥发油类。柴胡作为临床常用药，中成药制剂品种众多，且大多以煎煮法提取柴胡皂苷类成分，而多以水蒸气蒸馏法提取挥发油[2]，由于柴胡皂苷a、d化学结构均具不稳定性，遇酸或受热易分别降解生成活性较弱的次生苷b1、b2，，因此随着水蒸气蒸馏法提取时间的延长，柴胡皂苷a、d的量将逐渐降低，以致严重影响了柴胡制剂的质量和临床疗效。目前国内关于柴胡提取工艺的文献报道较多，但多以挥发油或柴胡皂苷a单独为指标进行考察，很少有同时考察挥发油和柴胡皂苷a的文献报道，更是未曾有文献报道过在保证挥发油提取率的同时还兼顾柴胡皂苷a的充分提取。因此，本文采用正交试验综合考察柴胡中挥发油吸收度和柴胡皂苷a含量，筛选最佳工艺，为提高柴胡制剂的质量和疗效打下坚实基础。1仪器与试药1.1仪器岛津LC-20A高效液相分析仪（SPD-20A紫外检测器）；752紫外分光光度计（上海精密仪器科技有限公司）；RE52—86A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；METTLERAE240电子分析天平（瑞士）1.2试药柴胡药材购于河南省药材公司，经本院陈随清教授鉴定为伞形科植物柴胡（BupleurumchinenseDC）的干燥根，柴胡皂苷a对照品自制，经峰面积归一化测定含量为：99.91%；乙腈为色谱纯；水为双重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。2方法2.1单因素试验分别以药材浸渍温度、浸渍时间、料液体积比、蒸馏液收集量等为因素，在不同水平下进行单因素试验，筛选出影响柴胡挥发油提取的主要因素和水平，同样分别以乙醇浓度、PH值、柴胡皂苷提取时间、料液体积比等为因素，在不同水平下进行单因素试验，筛选出影响柴胡皂苷的提取的主要因素和水平。从而为正交试验设计提供依据。2.2挥发油的提取和测定方法随机称取50g柴胡干燥粗粉，置于500ml圆底烧瓶中，采用水蒸气蒸馏法在不同条件下提取柴胡挥发油，收集蒸馏液，加3%丙二醇摇匀，精密量取上述蒸馏液2ml两份，一份置5ml容量瓶中，加水定容，摇匀，作为样品液，另一份置蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水溶解，转移至5ml容量瓶中，加水定容，摇匀，作为空白。用752紫外分光光度计在277nm波长处测定蒸馏液中挥发油的吸收度。2.3柴胡皂苷的提取取提取挥发油后的药渣，滤干，置于500ml圆底烧瓶中，在不同条件下回流提取柴胡皂苷，过滤得滤液,减压低温浓缩成每1ml含0.5g柴胡的浓缩液,备用。2.4柴胡皂苷a含量测定2.4.1色谱条件大连伊利特C18(4.6mm×250mm,5µm)；流动相：乙腈-水37：63；流速：1ml/min；检测波长208nm；柱温：35℃；进样量20µl.2.4.2对照品溶液的制备精密称取柴胡皂苷a对照品5.09mg，加甲醇溶解并定容至10ml，摇匀，配成0.509mg/ml对照品溶液,冷藏备用。2.4.3供试品溶液的制备取上述浓缩液10ml减压蒸干，加20ml甲醇溶解残渣，过滤得滤液。再取2ml滤液至10ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，冷藏备用。2.4.4线性范围考察精密吸取对照品储备液2.0、6.0、10.0、14.0、18.0µl，在“2.4.1”项下色谱条件下进样测定,记录峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，对照品溶液进样量X（µl）为横坐标，进行线性回归（n=5）,得线性回归方程为Y=209413.7X－162379.4，线性范围为：0.9720~9.635µg，相关系数为r=0.9997，线性关系良好。2.4.5精密度试验精密吸取对照品20µl，在“2.4.1”项下色谱条件下重复进样5次测定，记录峰面积，RSD为1.5%（n=5），表明精密度良好。2.4.6稳定性试验将供试品溶液在室温下贮存，在“2.4.1”项下色谱条件下，分别于0，2h，4h，6h，8h进样测定，记录峰面积，RSD为2.0%，表明样品在8h内稳定。2.4.7重现性试验精密称取同一批样品5份，按供试品溶液处理方法制备样品溶液，在“2.4.1”项下色谱条件下重复进样测定5次，记录峰面积，RSD为2.1%（n=5）2.4.8样品测定精密吸取20µl样品溶液，在“2.4.1”项下色谱条件下进样测定，记录峰面积，计算各样品中柴胡皂苷a的含量。2.5正交试验以柴胡蒸馏液中挥发油的吸收度和柴胡皂苷a的含量为检测指标，参照单因素试验结果，分别以药材浸渍温度、挥发油收集量、柴胡皂苷提取时间、柴胡皂苷提取溶剂料液比等主要因素及不同水平进行（L9(34)正交设计，筛选最佳工艺。正交试验因素和水平见表1表1正交试验因素及水平Tab1Factorandleveloforthogonaltest因素水平因素浸渍温度A收集量B提取时间C料液比D140℃2倍1h5倍260℃4倍2h6倍380℃5倍3h8倍3结果与分析3.1浸渍温度对挥发油提取效果的影响分别在30℃、40℃、60℃、80℃温度下浸渍6h,料液比1:6，提取一次，考察浸渍温度对挥发油提取效果的影响。测得吸收度依次为：0.303、0.984、0.758、0.587。由测定结果可知，在40℃下浸渍吸收度达到最大。且变化显著，所以浸渍温度应选在40℃左右。3.2浸渍时间对挥发油提取效果的影响在40℃下，分别浸渍0h、2h、4h、6h、8h,料液比1：6，提取一次，考察浸渍时间对挥发油提取效果的影响。测得吸收度依次为：0.470、0.559、0.650、0.940、0.722。由测定结果可知，浸渍6h吸收度最大，浸渍4h和8h吸收度相当。3.3料液比对挥发油提取效果的影响料液比分别为1：5、1:6、1：8、1:10,提取一次，考察料液比对挥发油提取效果的影响，测得吸收度依次为：0.316、0.443、0.337、0.258。由测定结果可见，料液比1：6吸收度最大。且变化显著。3.4挥发油收集量对挥发油提取效果的影响分别收集100ml、200ml、300ml蒸馏液，考察挥发油收集量对挥发油提取效果的影响，测得吸收度依次为：0.454、0.507、0.596。由测定结果可知。随着收集量的增多，吸收度逐渐增大，但增加趋势不显著。3.5乙醇浓度对柴胡皂苷提取效果的影响分别以95%、75%、60%、45%乙醇，料液比为：1:6，提取柴胡皂苷。考察不同乙醇浓度对柴胡皂苷提取效果的影响，柴胡皂苷a含量依次为：0.20%、0.15%、0.12%、0.12%。由测定结果可知，柴胡皂苷提取率随乙醇浓度的降低而降低。在95%乙醇浓度时最大。且变化较显著。因此选用95%乙醇提取。3.6PH值对柴胡皂苷提取效果的影响分别用0、5%、10%、15%的氨水95%乙醇液提取皂苷。考察PH值对柴胡皂苷提取效果的影响，柴胡皂苷a含量依次为：0.20%、0.25%、0.24%、0.24%。由测定结果可知，碱性乙醇提取效果比较好，含5%～10%氨水95%乙醇条件下提取液中柴胡皂苷a变化不显著，因此选用含5%氨水。3.7提取时间对柴胡皂苷提取效果的影响用95%乙醇分别在0.5h、1h、2h、3h、提取皂苷。考察提取时间对皂苷提取效果的影响。柴胡皂苷a含量依次为：0.20%、0.25%、0.20%、0.20%。由测定结果可知，提取1h时提取率最大。提取时间再长提取率就逐渐下降。3.8料液比对柴胡皂苷提取效果的影响在10倍、8倍、6倍、5倍、3倍不同料液比条件下回流提取柴胡皂苷。考察料液比对柴胡皂苷提取效果的影响。柴胡皂苷a含量依次为：0.15%、0.15%、0.20%、0.21%、0.14%。由测定结果可知，料液比为在5～６倍时提取率最大。3.9正交试验结果与分析3.9.1综合评分标准:因柴胡中的挥发油和柴胡皂苷a均为有效成分,权重应相等。则规定吸收度中最大值0.945及柴胡皂苷a含量中最大值0.33%为100,其余值对应比较,两项加和后平均得综合评分值,结果见表2,方差分析见表3。表2正交试验结果与分析Tab2Resultoforthogonaltest试验号列号试验结果综合评1234分因素吸收度含量（%）y(%)ABCDy1y211（40℃）1（2倍）1（1h）1（5倍）0.9450.2486.2621（40℃