氨基酸发酵工艺

张海龙山东教育学院生物系ShanDongInstituteofEducation氨基酸发酵工艺氨基酸发酵工艺氨基酸发酵工艺氨基酸发酵工艺第一节、概述•氨基酸的种类•氨基酸的应用：–在医药工业的应用–在食品工业的应用–在饲料工业的应用–在农业中的应用–在化学工业的应用一、氨基酸的种类及其应用约占20％药用和保健、化妆品及其他用途的氨基酸约占30％饲料添加剂约占50％　调味品及食品添加剂的二、氨基酸的生产方法•发酵法：–以淀粉质原料水解生成水解糖，利用氨基酸产生菌进行代谢发酵。•酶法：–利用微生物产生的酶来制造氨基酸的方法。•化学合成法：–此法生产的Ｄ、Ｌ型氨基酸，还要进行分割。•蛋白质水解提取法：–将蛋白质原料用酸水解，然后从水解液中提取氨基酸的方法三、氨基酸工业的发展现状和动态•氨基酸生产厂家多，但生产规模小、品种单一，缺乏竞争力；•生产工艺、生产水平和生产设备落后；•科研力量薄弱、分散。据国内统计，我国每年从国外进口各类氨基酸有10个品种，500多吨，消耗外汇4000多万美元。日本的：味之素、协和发酵、田边制药；德国的Degussa公司；法国的Rhone-Poulene公司；韩国的味元公司等。第二节、谷氨酸产生菌的特征及扩大培养•1、棒杆菌属：–主要特征主要特征主要特征主要特征：细胞为直或微弯的杆菌，常呈一端膨大的棒状，折断分裂形成“八”字形排列或栅形排列。不运动，少数植物致病菌能运动。革兰氏染色阳性，但常有呈阴性反应者，菌体内着色不均一，有横条纹或串珠状颗粒。好氧或厌氧。–谷氨酸发酵菌：谷氨酸发酵菌：谷氨酸发酵菌：谷氨酸发酵菌：北京棒杆菌AS1.299（C.Pekinensen）、钝齿棒杆菌AS1.542（C.crenatum）、谷氨酸棒杆菌（C.glutamicus）。（一）、谷氨酸产生菌的特征和分类（一）、谷氨酸产生菌的特征和分类•2、短杆菌属（Brevibacterium）：–主要特征：主要特征：主要特征：主要特征：细胞为短的不分支的直杆菌，革兰氏染色阳性。大多数不运动，运动的种具有周生鞭毛或端生鞭毛。在普通肉质蛋白胨培养基中生长良好。有时产非水溶性色素，色素呈红、橙红、黄、褐色。可以从乳制品、水、土壤、昆虫、鱼及植物体等样品中分离得到。–谷氨酸发酵菌：谷氨酸发酵菌：谷氨酸发酵菌：谷氨酸发酵菌：扩展短杆菌（B.divarcutum）、乳糖发酵短杆菌（B.lactofermentum）、嗜氨短杆菌（B.ammoniaphium）、黄色短杆菌（B.flavum）、硫殖短杆菌（B.thiogenitalis）、天津短杆菌T6-13。（一）、谷氨酸产生菌的特征和分类•3、小杆菌属（Microbacterium）：–主要特征主要特征主要特征主要特征：性状和排列都和棒状杆菌相似，有时呈球杆菌状．美蓝染色呈现颗粒，革兰氏染色阳性，不抗酸，无芽孢．在普通肉汁蛋白胨培养基上生长，补加牛奶或酵母膏则产生带灰色或黄色的菌落．发酵糖产酸弱，主要产乳酸，不产气．–谷氨酸发酵菌：谷氨酸发酵菌：谷氨酸发酵菌：谷氨酸发酵菌：水杨苷小杆菌（M.salicnovorum）、嗜氨小杆菌（M.ammoniaphilun）、产碱小杆菌（M.alkaliscrens）。（一）、谷氨酸产生菌的特征和分类•4、节杆菌属（Arthrobacter）：–主要特征主要特征主要特征主要特征：在培养过程中出现细胞形态由球菌变杆菌，由杆菌变球菌，革兰氏由阳性变阴性，又由阴性变阳性的变化过程。一般不运动。固体培养基上菌苔软或黏，液体培养生长旺盛。大部分的种液化明胶，从碳水化合物产酸极少或不产酸。好氧。大部分的菌种在37度不生长或微弱生长，最适生长温度20~25度。–谷氨酸发酵菌谷氨酸发酵菌谷氨酸发酵菌谷氨酸发酵菌：氨基酸节杆菌新种（A.aminofurmis）、裂烃谷氨酸节杆菌（A.hydrocarboglutamicus）、石蜡节杆菌（A.paraffineus）。（二）、工业生产中使用的谷氨酸菌株•棒杆菌属：北京棒杆菌AS1.299、钝齿棒杆菌AS1.542、HU7251、7383、B9、T6-13•短杆菌属：617、672•在正常情况下谷氨酸发酵产酸率可达4%~6%，谷氨酸对糖的转化率为40%~50%。二、谷氨酸菌种的扩大培养•种子的质量要求–镜检菌体健壮，排列整齐，大小均一，呈单个或八字形排列。革兰氏阳性。–二级种子的活菌浓度要求达到　　　　个／mL。–种子活力旺盛–平板检查，菌落淡黄色，中间隆起，表面湿润，有光泽，边缘整齐，呈半透明状。–小摇瓶发酵试验，产酸稳定并在高峰。hhhCCC10~71224~18323232　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　种子罐　　　　　　　　　　三角瓶发酵罐二级种子培养一级种子培养斜面菌种°°°→→→9810~10第三节、淀粉水解糖的制备•作为Glu发酵原料的水解糖液，必须具备以下条件：–①糖液中还原糖的含量要达到发酵用糖的标准。–②糖液洁净、杏黄色或黄绿色，有一定的透光度。–③糖液中不含糊精。–④糖液不能变质。原料：薯类（甘薯、木薯等）、玉米、小麦、大米（或碎米粉）一、制备方法•酸解法–以酸为催化剂，在高温高压下将淀粉转化为葡萄糖的方法•酸酶法–先将淀粉用酸水解成糊精或低聚糖，再用糖化剂水解成G•酶酸法–将淀粉先用α—淀粉酶液化，然后用酸水解成葡萄糖。•双酶法–用淀粉酶和糖化酶将淀粉水解成葡萄糖的工艺。有机酸、有色物质复合低聚糖－羟甲基糠醛复合二糖分解反应复合反应葡萄糖淀粉水解反应淀粉‘5↓↓⇕酸法与双酶法糖液质量比较少少长大低交酸法高10％有利多多短小高较低差过程能耗过程能耗过程能耗过程能耗副产物副产物副产物副产物生产周期生产周期生产周期生产周期设备规模设备规模设备规模设备规模防腐要求防腐要求防腐要求防腐要求葡萄糖收得率葡萄糖收得率葡萄糖收得率葡萄糖收得率适合发酵生适合发酵生适合发酵生适合发酵生产工艺情况产工艺情况产工艺情况产工艺情况9897%0.1%0.1%0.003%0.298%高温9186％1.6%0.08%0.30%10.090%高温高压葡萄糖值葡萄糖值葡萄糖值葡萄糖值(DE(DE(DE(DE值值值值))))葡萄糖含量葡萄糖含量葡萄糖含量葡萄糖含量((((干基干基干基干基))))灰分灰分灰分灰分蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质羟甲基糠醛羟甲基糠醛羟甲基糠醛羟甲基糠醛色度色度色度色度淀粉转化率淀粉转化率淀粉转化率淀粉转化率工艺条件工艺条件工艺条件工艺条件双酶法双酶法双酶法双酶法酸水解法酸水解法酸水解法酸水解法项目项目项目项目双酶法双酶法双酶法双酶法酸水解法酸水解法酸水解法酸水解法项目项目项目项目二、固定化酶在淀粉糖制备中的应用•定义：将水溶性的酶用物理或化学的方法处理，使将水溶性的酶用物理或化学的方法处理，使将水溶性的酶用物理或化学的方法处理，使将水溶性的酶用物理或化学的方法处理，使之变成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物之变成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物之变成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物之变成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物。。。。•特点：–①易与底物、产物分开，简化了提纯工艺。–②能够分批和连续反应，便于实现连续化和自动化。–③大多数情况下，能够提高酶的稳定性酶的稳定性酶的稳定性酶的稳定性。–④酶的利用率提高，生产成本降低。–⑤只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，不适宜多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。（一）、固定化酶（immobilizedenzymeimmobilizedenzymeimmobilizedenzymeimmobilizedenzyme）的定义（二）、固定化酶的制备方法•1、吸附法:–酶被吸附于惰性的固相载体或离子交换剂上.–物理吸附法：•酶被吸附于不溶性载体的一种固定方法。•特点：酶活中心不易被破坏和酶的高级结构变化少，因而酶活力损失很少；但酶与载体相互作用力弱、酶易脱落。–离子吸附法：•利用含离子交换基团的固相载体与酶蛋白的带电基团相互吸引而形成的络合物。•特点：处理条件温和，酶的高级结构和活性中新的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶；高离子强度下易脱落。（二）、固定化酶的制备方法•2、载体偶联法–将酶蛋白的非必需基团通过共价键与载体形成不可逆的连接.•天然高分子•合成的高聚物–特点：•结合牢固，可以长时间使用。•载体活化的操作复杂，由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构变化，破坏酶活中心。（二）、固定化酶的制备方法•3、交联法–借助于双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物细胞与微生物细胞之间发生交联反应,制成网状结构的固定化酶。–特点：交联法反应条件比较强烈，固定化的酶活回收率一般较低，但是尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间有利于固定化酶活力的提高。•4、包埋法:–网格型:将酶包埋于高分子凝胶细微网格中–微囊性:将酶包埋于高分子半透膜中.固定化酶方法的优缺点比较难强中有变化不可能高难强中有变化不可能中易强高无变化不可能中易弱高无变化可能低易中高无变化可能低制备结合力酶活力底物专一性再生固定化费用交联法交联法交联法交联法偶联法偶联法偶联法偶联法包埋法包埋法包埋法包埋法离子结合离子结合离子结合离子结合法法法法物理吸附物理吸附物理吸附物理吸附法法法法特征特征特征特征（三）、固定化酶的性质•固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也可能发生变化。•可能原因：–固定过程中，空间构象会发生变化。–固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻）。–包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子物质不能透过膜与酶接触。–个别情况：酶在固定化后比原酶活力提高，可能是由于偶联个别情况：酶在固定化后比原酶活力提高，可能是由于偶联个别情况：酶在固定化后比原酶活力提高，可能是由于偶联个别情况：酶在固定化后比原酶活力提高，可能是由于偶联过程中，酶得到化学修饰或固定化过程提高了酶酶活稳定性。过程中，酶得到化学修饰或固定化过程提高了酶酶活稳定性。过程中，酶得到化学修饰或固定化过程提高了酶酶活稳定性。过程中，酶得到化学修饰或固定化过程提高了酶酶活稳定性。1111、固定化酶的活力（三）、固定化酶的性质2、固定化酶的最适pH变化•酶固定化后，酶活力－pH曲线常发生偏移。•跟载体的带电性质有关。50607080901005678910固定化酶游离酶天冬酰胺酶固定化前后的酶活力————pHpHpHpH曲线相对酶活力％pH（三）、固定化酶的性质3、固定化酶的最适温度•经固定化后，大多数酶的热稳定性提高，最适温度也随之提高。（三）、固定化酶的性质4、固定化的酶稳定性•大多数情况下固定化酶的稳定性较天然酶高。–首先，固定化酶的热稳定性提高；–其次，在各种有机溶剂中的稳定性提高；–此外，固定化酶对不同pH值的稳定性、对蛋白质作用的稳定性、贮存稳定性和操作稳定性都优于天然酶。•可能原因：–固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶伸展变形；–抑制酶的自降解，将酶与固体载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解。第四节、谷氨酸发酵机制及工艺控制•一、氨基酸发酵的代谢控制•二、谷氨酸生物合成途径•三、谷氨酸生产原料•四、谷氨酸发酵条件的控制•五、提高谷氨酸发酵产率的措施一、氨基酸发酵的代谢控制1、控制发酵的环境条件•氨基酸发酵受菌种的生理特征和环境条件的影响，对专性需氧菌来说后者的影响更大。乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸←→←→←→←→谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸←→←→←→←→αααα－酮戊二酸－酮戊二酸－酮戊二酸－酮戊二酸（通气不足）（适量）（通气过量，转速过快）αααα－酮戊二酸－酮戊二酸－酮戊二酸－酮戊二酸←→←→←→←→谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸←→←→←→←→谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺（缺乏）（适量）（过量）谷氨酰胺，谷氨酰胺，谷氨酰胺，谷氨酰胺，N－乙酰谷酰胺－乙酰谷酰胺－乙酰谷酰胺－乙酰谷酰胺←→←→←→←→谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸（pH值5～8，氨离子过多）（中性或微碱性）缬缬缬缬氨氨氨氨酸酸酸酸←→←→←→←→谷氨