氨基酸发酵工艺学

第三章氨基酸发酵工艺学学习氨基酸发酵工艺学的目的、研究对象、任务及内容氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵，由发酵所生成的产物——氨基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积累是建立在对微生物正常代谢的抑制。在脱氧核糖核酸(DNA)的分子水平上改变、控制微生物的代谢，使有用产物大量生成、积累。以探讨氨基酸发酵工厂的生产技术为主要目的。氨基酸的生产以发酵为主，发酵过程的控制是整个生产的关键，产物的提纯及设备选用当否，也会影响产物得率。氨基酸发酵工艺学研究的对象应该包括从投入原料到最终获得产品的整个过程，其中有微生物生化问题、生化工程问题，也有分析与设备问题。今后的发展是采用诱变、细胞工程、基因工程的手段选育出从遗传角度解除了反馈调节和遗传性稳定的更理想菌种，提高产酸；采用过程控制，优化工艺进行连续、自动化生产获得稳产高产；探求新工艺、新设备,以提高产率；研究发酵机制问题，以便能更好地控制氨基酸微生物中间代谢产物的发酵。绪论第一节、氨基酸概论1、氨基酸简介–构成蛋白质的基本分子单元。–α碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。–目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。NH3CHCOOHRCHNH2COO-R+2、氨基酸的用途（1）食品工业：强化食品：赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。（2）饲料工业：甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料，添加蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸等必须氨基酸可促进动物生长发育、改善肉质、节省蛋白饲料、降低成本等。（3）医药工业：多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调氨基酸注射液由1985年的100万瓶增长到2003的1.5万瓶，每年以15-20%的速度递增，全行业的年产值预计能达到10亿元苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。（4）化学工业：谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维（合成高分子化合物）。能保持皮肤湿润的润肤剂——焦谷氨酸钠和质量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革，以及人造纤维和涂料。表3--8世界氨基酸主要生产厂家生产能力品名厂家生产能力品名厂家生产能力蛋氨酸日本曹达20000谷氨酸味之素60000蛋氨酸日本住友化学5000谷氨酸日本旭化成15000蛋氨酸日本化药2500谷氨酸协和发酵15000蛋氨酸德国迪高沙85000谷氨酸日本武田药品15000蛋氨酸法国AEC105000色氨酸味之素100蛋氨酸美国孟山都45000色氨酸昭和电工200蛋氨酸墨西哥阿尔拜梅克斯5000色氨酸三井东压100蛋氨酸西班牙Sodeti4000色氨酸田造制药50蛋氨酸苏联Volgograd4000色氨酸日本化药50色氨酸协和发酵50赖氨酸日本味之素55000甘氨酸日本有机合成化学6000赖氨酸日本协和发酵20500甘氨酸协和发酵5000赖氨酸日本东丽6500甘氨酸日本化药1000赖氨酸南朝鲜味元10000丙氨酸武藏野化学研究所——丙氨酸日本化药——3、氨基酸的生产方法发酵法：直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。包括添加前体发酵法：如用邻氨基苯甲酸，生产L-色氨酸；甘氨酸生产L-丝氨酸。酶法：利用微生物细胞或产生的酶来制造氨基酸。延胡索酸和铵盐为原料，经天冬氨酸酶催化生产L-天冬氨酸。提取法：常用毛发、血粉等蛋白质原料水解，从中提取。如胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸合成法：合成法获得DL-蛋氨酸、不对称合成法获得L-氨基酸。如丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产的目的。第二节、氨基酸发酵菌株的育种是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之一发酵工程要求微生物大量地合成特定的代谢产物，这一目的只有当微生物的部分代谢调控机制遭到破坏时才能达到。用人工诱变的方法有目的地改变微生物固有的调节机制，使合成产物的途径畅通无阻，最大限度地积累特定产物，这种发酵称为代谢控制发酵。1、用野生菌株的方法分离的野生菌株具备积累产物的特性，可用于直接发酵（产率低）。如谷氨酸发酵。通过转换发酵，可延伸获得其它产物。主要采用改变培养条件。如谷氨酸发酵中改变铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵。2.用营养缺陷变异株的方法通过诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生物合成在中途停止，不让最终产物起调控作用。如用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，谷氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，异亮氨酸缺陷菌株的脯氨酸发酵。谷氨酸棒状杆菌的苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的合成是与分枝途径相联系的(图4-8)，筛选高丝氨酸营养缺陷型后，限量供给苏氨酸时，就能解除由苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制作用，而获得赖氨酸的过量生产。这是因为仅有赖氨酸或苏氨酸存在时，天冬氨酸激酶不被抑制，只有两者的协同效应才能造成抑制。在限量供给苏氨酸的情况下，即使赖氨酸过剩，抑制作用也很难发生。3.类似物抗性变异株的方法用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。高丝氨酸脱氢酶例如，在黄色短杆菌的赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸生物合成中（图5-16所示），选育抗苏氨酸结构类似物2-氨基-3-羟基戊酸（AHVr）突变株，得到了具有反馈抑制抗性，高丝氨酸脱氢酶活性提高1300倍，能积累14g/L苏氨酸的突变株。4.体内及体外基因重组的方法基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体，在两条DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性重组现象。细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础上，应用重组DNA技术可以改变代谢途径分支点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代谢网络。其主要步骤为:鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶);取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点(增强活性或稳定性、解除反馈抑制等);将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节元件一起克隆进目标生物;使调节元件的作用及培育条件最优化。5、基因工程菌通过基因工程技术，构建理想的工程菌株5.1载体-受体系统及克隆表达的研究受体的获得目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌K-12及棒状杆菌家族，通常是通过诱变选育出的基础产率较高的菌株。大肠杆菌遗传背景研究得清楚，载体系统完善，利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将蛋白产物分泌至胞外，为应用带来困难。棒状杆菌能克服这两个缺点，但载体受体系统研究较晚且有限制修饰系统的障碍，所以获得利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体菌是尚待解决的问题。5.2载体的构建有效的载体需要有在受体菌中可启动的复制起始位点，这可从棒状杆菌家族内源小质粒中获得;载体所需的筛选标记及外源基因插入的多克隆位点，可从常用的克隆载体中获得。5.3基因转移手段通常采用的方法有:原生质体转化、转导，电转化，接合转移。原生质体转化的方法是较早采用的方法，由于受到原生质体再生条件的局限，效率不高;电转化方法由于高效，快速被广泛使用，目前它的转化效率可达到原生质体转化法的100-1000倍。接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于稳定遗传。第三节氨基酸发酵的代谢控制控制发酵的条件控制细胞渗透性控制旁路代谢降低反馈作用物的浓度消除终产物的反馈抑制与阻遏作用促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成一、菌种的代谢调控是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之二1、控制发酵环境条件–专性需氧菌，控制环境条件可改变代谢途径和产物。2、控制细胞渗透性•生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。•细胞内生物素水平高，Glu不能通过细胞膜•青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞面内外的渗透压而泄露出来。•表面活性剂增加细胞膜通透性氨基酸发酵必须考虑的重要因素细胞透性的调节细胞透性的调节，一般通过向培养基中添加化学成分（如生物素、油酸、甘油、表面活性剂、青霉素等，达到抑制磷脂、细胞膜的形成或阻碍细胞壁的正常生物合成，使谷氨酸生产菌处于异常生理状态，解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。生物素：影响磷脂的合成及细胞膜的完整性。油酸：直接影响磷脂的合成及细胞膜甘油：甘油缺陷型菌株丧失α-磷酸甘油脱氢酶，不能合成α-磷酸甘油和磷脂。限量供应，控制了细胞膜中与渗透性直接关系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而积累。表面活性剂：对生物素有拮抗作用，拮抗不饱和脂肪酸的合成，导致磷脂合成不足，影响细胞膜的完整性，提供细胞膜对谷氨酸的渗透性。青霉素：抑制细菌细胞壁的后期合成，形成不完整的细胞壁，使细胞膜失去保护，使胞内外的渗透压差导致细胞膜的物理损伤，增大谷氨酸向胞外漏出的渗透性、生物素阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成表面活性剂对生物素有拮抗阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成在对数生长期添加青霉素抑制细胞壁合成细胞膜损伤甘油缺陷型磷脂的合成受阻影响细胞膜的合成油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成影响细胞膜的合成提高细胞膜的谷氨酸通透性控制磷脂的合成使细胞膜受损（如表面活性剂）青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜控制磷脂含量通过油酸的合成通过甘油合成直接控制磷脂合成3、控制旁路代谢4、降低反馈作用物的浓度利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸的量。限制瓜氨酸的浓度可解除反馈抑制，实现鸟氨酸的生物合成。5、消除终产物的反馈抑制与阻遏作用–使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法或者通过选育营养缺陷型菌株。6、促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成ATP的积累可促进氨基酸的生物合成第四节、谷氨酸生物合成及其发酵生产调控HOOCCH2CH2CHCOOHNH2代谢控制发酵是用遗传学或其他生物化学的方法，人为地在分子水平上改变和控制微生物的代谢，打破微生物正常的代谢调节，使有用产物大量生成和积累。氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵，发酵技术的关键是打破微生物的正常代谢调节，人为控制微生物的代谢。一.谷氨酸的生物合成途径异柠檬酸裂解酶α-酮戊二酸脱氢酶1、谷氨酸生物合成中的几个途径（正常途径）（1）糖酵解途径（EMP）（2）磷酸已糖途径（HMP)（3）三羧酸循环(TCA环)（4）乙醛酸循环（DCA环）（5）二氧化碳固定反应PEP+CO2+GTP草酰乙酸+GDP丙酮酸+CO2+NADH苹果酸+NAD草酰乙酸CO2NAD+NADH+H+（6）α-KGA的还原氨基化反应PEP羧化酶苹果酸酶苹果酸脱氢酶C6H12O6+NH3+O2→C5H9O4N+CO2+3H2O在GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径：①苹果酸酶②丙酮酸羧化酶③磷酸烯醇丙酮酸羧化酶CO2固定反应(丙酮酸羧化支路)2、GA生物合成的理想途径（1）GA产生菌必须具备以下条件（内在因素）α-酮戊二酸脱氢酶的活性微弱或缺失TCA环阻断，α-酮戊二酸积累琥珀酸辅酶ATCA环正常GA产生菌体内的NADPH的氧化能力欠缺或丧失积累NADPH，抑制α—KGA的脱羧氧化GA产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶通过该酶酶活性调节实现DCA循环的封闭，GA发酵积累菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性α—KGA+NH4++NADPH==GA+NADP提供NADPH,用于还原α-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化还原共扼体系该反应