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注射剂无菌保证工艺研究与验证常见技术问题[注：以下均为2008年度第一期讲习班（注射剂无菌保证工艺研究与验证技术要求）参会代表所提问题，本期讲习班讲习组根据目前的有关技术要求，经过认真梳理、分析、总结后，现予以发布，并就相关问题进行讨论与交流。]1、按照欧盟决策树的要求，不能达到121℃，15分钟灭菌，可选择F0≥8的残存概率法。请问，若产品能达到121℃，12分钟灭菌，是否就不能选择121℃，10分钟，同样，能达到10分钟，就不能选择8分钟，都是F0≥8的情况。答：从微生物杀灭的数学模型可知，在初始污染相同的情况下，灭菌F0值越大，无菌保证水平越高。因此，显然为降低产品残留微生物的风险，尽量选择高的F0值是顺理成章的。2、在产品质量稳定的条件下，均能满足121℃，8分钟和115℃，30分钟，哪个条件应该优先选择呢？答：不考虑产品理化质量稳定性，理论上这两种条件达到的F0值几乎相等，无所谓优选哪个。但实际生产中，还要考虑灭菌器内产品中热穿透的情况，灭菌器内不同部位的产品实际获得的F0值的差异，不同灭菌批次间产品的F0的差异等。应该选择热分布差异小，产品F0值差异较小的灭菌工艺。2℃，灭菌30分钟”，这种表示法是否规范？3、申报资料中的灭菌条件为“101℃40min。15min或116℃2℃，灭菌30分钟”几乎不能计算F0值。灭菌条件的表示可以参照中国药典2005年版二部附录168灭菌法，121℃2℃，灭菌30分钟”本身不能称为终端灭菌，因“101℃2℃，灭菌30分钟”是否规范，“101℃答：暂不说灭菌条件为“101℃4、同品种10ml、20ml注射剂，采取相同的灭菌方式是否合适？答：同品种10ml、20ml注射剂，可以采取相同的灭菌方式，但应进行热穿透试验，考察不同体积样品的热穿透是否有一致，同时考虑采用的灭菌方式应能保证大体积产品的无菌保证水平。5、选择最高无菌保证水平的灭菌工艺，可能会与产品的质量，如有关物质、稳定性等方面有冲突，如何平衡这一矛盾？另外，国外上市的是粉针剂，国内申报时是否还需要进行灭菌工艺的选择研究？答：实际上，在进行灭菌工艺选择研究过程中就应该进行不同灭菌条件下样品质量变化的研究，选择灭菌工艺的过程也是平衡无菌保证水平和（样品质量）理化指标的过程，在产品有临床需求的情况下，灭菌工艺的选择应以其自身能达到的最高无菌保证水平为原则。对国外上市的粉针剂，国内申报时也应对其采用粉针剂型进行研究，如主药确系对热、对水分不稳定，则可以采用与国外相同的粉针剂；如果主药不是对热、对水分不稳定，则应根据主药的性质选择无菌保证水平高的剂型。6、最终灭菌工艺的选择原则是首选F0≥12，而不是F0≥8；还是只要达到F0≥8即可？答：可参考欧盟灭菌工艺选择的决策树。7、决策树中残存概率法是否亦优先选择121℃的温度条件？答：不一定，要根据产品的稳定性确定，如果采用更高温度和更短的时间能满足残存概率法时，可能比较低温度，更长时间的灭菌条件对产品更有利。如果产品不能耐受121℃的高温，则可以降低温度，并保证微生物的残存概率小于10-6。8、对热不稳定药品（如蛋白质类、生物制品等），应该直接进行无菌生产工艺的验证。答：对热不稳定药品（如蛋白质类、生物制品等），首先应对采用的无菌工艺进行研究，是采用除菌过滤+无菌生产工艺，还是采用无菌组装工艺；然后再对无菌工艺进行验证。9、是否在产品注册申报时就已形成本产品的完整的工艺规程中规定的各项参数的验证？答：药品注册管理办法规定，申请人在申报“药品注册申请表”后，经药品审评中心审评符合规定的，通知申请人向药品认证管理中心申请生产现场检查，现场检查目的是确认核定生产工艺的可行性，同时抽取1批样品，并规定样品的生产应当符合GMP要求。由此可见，申报产品注册时，应对用于正式上市产品生产的工艺有了足够的认识。这种认识是建立在产品和工艺开发，扩产、设备和系统的验证以及验证批的生产整个过程上的。验证批的目的是要证明在规定的工艺参数的范围内，工艺过程能始终生产出合格的产品来。因此，在进行验证批生产前，应已充分了解并能控制工艺中各种关键的可变因素。10、在进行灭菌工艺验证时，一般会放置一个校验的探头在灭菌柜控制探头旁边，这两者之间的温度差异有什么要求？是否应按校样标准，只允许±0.5℃的偏差？答：一般来说:a：灭菌器自带的独立的记录探头与监控探头就应完成足够的验证数据，然后对存在的偏差作修正；b：验证所用的测温探头的精度应优于灭菌器自带的记录探头和监控探头；c：验证本身的作用之一是对灭菌器自带的监控探头和记录探头进行修正，以便正常使用时达到较为准确的温度值。目前没有找到“只允许±0.5℃的偏差”的说法。11、在同一条大容量注射剂生产线上，如果有一台灭菌柜，需要进行多个规格产品（如250ml,100ml）以及不同灭菌参数产品（比如灭菌温度和时间不同）的灭菌，那么在进行验证和再验证的过程中，如何进行热分布以及热穿透的验证设计？是否各种规格、各种灭菌条件均需分别进行验证？答：一般来说，各种规格、各种灭菌条件均需分别进行验证。不同规格混合装载的灭菌，除非能够确认很多的相关内容，否则不推荐应用。12、在对湿热灭菌器进行验证或再验证过程中，进行热分布、热穿透的验证时，如果柜内设置12个或16个热电偶进行温度测试时，找到的冷点在3次验证中可能不同，如果出现这种情况该如何处理？答：一般来说，空载热分布的冷点应该是在确定的位置周围，否则就可能是设备、压力、空气置换不完全、蒸汽质量等原因引起。对于装载热穿透，大容量注射剂（LVP，100ml）冷点位于产品的几何中心和沿纵轴位于产品的底部，但需要验证确认。冷点的定位在小容量注射剂中并不典型，因为溶液加热的速率几乎与灭菌器相同。还有，容器的方向也会影响冷点的位置，当容器旋转或翻转时，可能不存在可辨别的冷点。如果装载不变，容量相同，蒸汽穿透不存在阻隔等，冷点仍然无法重现，则应检查设备、工艺、压力、蒸汽质量等方面可能存在的不确定性。13、满载热分布和空载热分布对于灭菌效果上体现出的意义有何不同？答：两项试验都是测量灭菌腔室的温度分布情况，还不反映产品内的温度和热效益的情况，还不能直接反映产品的灭菌效果。但腔室情况显然会影响产品内的情况。验证中依次进行空载热分布、满载热分布、产品热穿透试验。采用这种试验的主要目的是用尽量少的试验次数，尽可能地揭示客观情况。前道试验的结果为后道试验提供信息。14、满载热分布试验是用空瓶进行还是用装注射用水的输液瓶进行？答：满载热分布试验是用模拟样品进行。15、如验证时的装载方式为半载或满载，在以后生产中处于满载和半载之间的是否需要验证？答：对于处于满载和半载之间的装载方式，建议使用模拟产品填充使其达到满载，从而确保生产时的装载方式与验证时一致。16、热穿透试验怎么做？答：热穿透试验的目的是确定灭菌室装载中的“最冷点”，并确认该点在预定的灭菌程序中获得充分的无菌保证值，即菌种残余量≤10-6及各检测点温度与灭菌室内平均温度的差值≤2.5℃。对于可能影响灭菌效果的操作情况的变更应做相应的验证，确认操作方法。例如：当在每个灭菌盘上增加不锈钢盖后，实际产品（溶液）内部的升温时间要比不加盖时慢2分钟，因此要在灭菌程序设定时增加2分钟的时间。热电偶的放置与满载热分布试验规程一致，将标准热电偶放在灭菌溶液中心部位。17、热穿透试验中的模拟样品是什么概念，是指实验室小批量样品吗？答：热穿透试验中的模拟样品是指热穿透性能与真实样品一致的样品，不是实验室小批量样品。18、微生物挑战试验的生物指示剂的种类需要根据品种选择吗？如何选择？答：微生物挑战试验的生物指示剂的种类及选择可以参考中国药典2005年版二部附录169灭菌法。19、灭菌前微生物污染水平的测定方法？答：滤膜过滤法是最常用的方法。使用前应通过验证。20.产品的微生物限度检测结果为0CFU，没有发现耐热微生物，那么验证过程中能否采用D值稍低的枯草芽孢杆菌作为生物指示剂进行验证？答：1）、微生物限度的检测结果和选择D值稍低的枯草芽孢杆菌作为生物指示剂之间不存在因果关系。2）、根据提问者的问题，可以认为其采用的是残存概率法的灭菌工艺。对于残存概率法的灭菌工艺可以选择生物指示剂进行残存概率测试，仅仅是因为产品或包装本身不能承受过度杀灭，从而选择比较严格的过程控制，加上产品的初始菌数量控制，或者再加上除菌过滤工艺等等，然后选择生物指示剂进行灵敏度测试，测出平均含菌量N0，再进行不少于4个梯度菌量、足够批次、数量的产品的灭菌前后微生物限度测试（若必需，对不同灭菌时间也要进行测试），寻找并得到大于下降6个对数等级的状态参数，在满足F0值在8~12之间的条件下，从而推算出D值。21、请问灭菌前微生物污染水平和耐热性（D值）的测试方法？答：微生物污染水平通常采用滤膜过滤法截留微生物，再将滤膜转移到固体培养基表面，培养并作微生物计数。应注意过滤的体积、截留微生物的数量，保证足够的检出率（足量的过滤量）和可计数性（截留的微生物太多就没法计数了）。每批产品都进行的耐热性测试并非D值测试，而是所谓沸腾试验－一种定性试验。将截留了微生物的滤膜放入装有同种产品药液的试管中，进行水浴煮沸15分钟或更长时间，对该药液进行无菌检查，如阴性则通过，呈阳性，说明污染菌是耐热菌，则需要进一步测D值。99%以上的检品是非耐热菌。D值测定相当复杂，请参考《药品生产验证指南》（蓝皮书，国家药监局编）第三篇第三章第一节，有详细介绍。22、怎样根据D值计算接种量？答：芽孢接种量的计算：Ni＝10Do(lgNo+6)/Di其中Ni为生物指示剂耐热孢子接种数量No为预定产品中灭菌前污染微生物的限度Do为污染微生物允许的最大D值Di为生物指示剂耐热孢子在产品中的D值23、对于选择残存概率法最终灭菌的产品，如果灭菌前每批检测微生物限度，而微生物限度检测时间为72小时，而实际连续生产的生产周期远远短于72小时，其检测结果仅是对灭菌后产品无菌保证水平的参考吗？答：显然灭菌前微生物含量检查的结果远远滞后于生产过程，其目的不是用于对当批产品的中间控制。该检查的意义主要有两项：第一，用于评价该批产品的无菌保证水平；第二，长期积累了多批灭菌前微生物含量的数据后，可以对生产系统在灭菌前的各工艺步骤的微生物污染状况作整体的评估，从而指示该生产体系是否有效地将微生物污染控制在很好的水平，是否需要进行改进等。24、请问微生物种类、数量研究的方法？所需的设备？如果采用残存概率法，是否在生产过程中必须对微生物水平进行测定，如果引入将增加多少成本？作为大输液生产企业，采用残存概率法，是否要建立专门的微生物实验室检测灭菌前药液微生物污染水平？答：微生物污染的程度－即数量的检查可以按照药典收载的微生物限度检查方法进行；微生物的种类即鉴别可以从以下几方面依次展开：1）通过肉眼观察菌落形态；2）镜检形态和运动性；3）一般生化试验：革兰氏染色或3％KOH试验；4）生化鉴定（即API试验）鉴别到种。采用残存概率法时，应该检测产品灭菌前微生物污染水平，包括污染菌的煮沸试验（如100℃，15分钟）和微生物计数。注射剂生产企业，微生物实验室是必不可少的，其基本功能应包括原辅料的微生物限度检查，产品灭菌前微生物污染量检查，产品无菌检查，细菌内毒素检查，生产环境动态检查（空气微粒、浮游菌和沉降菌计数）。有条件的实验室还可开展以下工作：微生物的鉴别试验（建议企业集团的中心实验室开展API鉴定），生物指示剂的标定（即D值测定，建议企业集团中心实验室开展该项工作）。25.对于过度杀灭法是否需要进行灭菌工艺验证？残存概率法的产品研发工艺研究与实际生产中验证有何区别？答：当然需要验证，欧盟CGMP附录第83条:所有的灭菌工艺都应验证。残存概率法是灭菌工艺的设计，本身就需要验证确认。26、过度杀灭法是否确定不需进行微生物挑战试验？答：过度杀灭法的内涵是产品中的微生物下降12个对数，微生物挑战试验是证明微生物的残存概率不大于10-6，故过度杀灭法可以不进行微生物挑战试验。27、最终灭菌产品是否每个申请注册的品种