第五章发酵工艺过程控制

第五章发酵工艺过程控制第一节发酵的操作方式第二节温度变化及其控制第三节pH变化及其控制第四节溶解氧及其控制第五节泡沫对发酵的影响及控制第六节发酵染菌及其防治第七节发酵终点的判断工艺条件控制的目的：就是要为生产菌创造一个最适的环境，使我们所需要的代谢活动得以最充分的表达。第一节发酵的操作方式分批发酵补料分批发酵（半连续发酵）连续发酵一、分批发酵（batchcultureorfermentation）向反应器中一次投入所需的培养基，然后接种培养，培养过程中除控制温度和pH外（O2和CO2及消泡剂除外）不进行其他任何控制，反应结束后将全部培养液排出进行处理。1.概念：分批培养中微生物的生长迟滞期对数生长期稳定期死亡期延滞期（迟滞期）：把微生物从一种培养基中转接到另一培养基的最初一段时间里，尽管微生物细胞的重量（W﹠V)有所增加，但细胞的数量没有增加。指数生长期：如以细胞数目或生物量的对数对时间作一对数图，将得一直线，因而这一时期称作指数生长期。对细菌、酵母等单细胞微生物来讲，单位时间内其细胞数目将成倍增加。对于丝状微生物而言，单位时间内其生物量将加倍。稳定期：培养基中的底物不断被消耗，一些对微生物生长代谢有害的物质在不断积累，微生物的生长速率和比生长速率逐渐下降，直至完全停止，这时就进入稳定期。生物量增加十分缓慢或基本不变；微生物细胞的代谢还在旺盛地进行着，细胞的组成物质还在不断变化。死亡期：细胞的营养物质和能源储备已消耗殆尽，不能再维持细胞的生长和代谢，细胞开始死亡。微生物细胞的死亡呈指数比率增加。在发酵工业生产中．在进入死亡期之前应及时将发酵液放罐处理。2.特点：整个培养系统与外界没有其它物质交换（O2、CO2、消泡剂、酸碱除外）。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度不断变化，是一种非稳态的培养方法。3.分批发酵的优缺点优点:操作简单；周期短，不会产生菌种老化和变异等问题；染菌机会少；生产过程和产品质量容易掌握。缺点:产率低：非生产时间较长、设备利用率低。但由于操作相对较易，目前仍是发酵工业的主要方式二、连续发酵（continuousculture）1.概念：微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中不断添加新鲜的培养基，同时不断放出等量代谢物，使微生物细胞在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的培养方式。连续不断地补加新鲜培养基，连续不断地排出培养物2.特点：菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度均处于恒定状态。3.连续培养的优缺点缺点:长期连续培养会引起菌种退化；染菌机会增加。应用：废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发酵等工业中。1）省去了反复放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避免了延迟期，提高设备的利用率和单位时间产量。2）发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制；3）易于分期控制，可以在不同罐中控制不同的条件。优点:例题：下列对微生物连续培养优点的叙述，不正确的是()。A．能及时连续补充微生物所需的营养物质，提高产量B．有利于微生物尽快将代谢产物释放到培养基中C．提高了设备利用率且便于自动控制与管理D．能及时排除部分有害代谢产物B三、补料分批发酵（fed-batchculture）介于分批培养和连续培养之间的操作方法。1.概念：根据菌体生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当（间歇或连续地）补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长。反复补料分批培养随着补料操作的进行，发酵液的体积逐渐增大，到了一定时候将部分发酵液取出，剩下的发酵液继续进行补料分批培养，如此可反复进行多次，称为反复补料分批培养。2.补料方式：间歇添加营养物质后，其在发酵液中的浓度即会上升，然后随着微生物的利用又下降；再次补入料液后，营养物质浓度再次升高，然后再次下降，呈现较大的波动。间歇添加法连续流加法恒速流加(constant-flowrate)指数流加(exponential-flowrate)◇恒速流加操作的补料速度是定值，操作简便，设备简单；最常用；◇发酵液体积呈线性增长；由于在指数生长期，微生物的底物消耗也呈指数增加，恒速流加不能维持底物浓度不变，底物浓度会随时间延长而逐渐降低。◇指数流加补料的加入量呈指数规律增长，能在短时间内得到最大量细胞，还可通过变更流率指数来控制比生长速率；◇但装置相当复杂3.补料分批培养的优缺点优点：与分批培养相比(1)解除底物抑制和葡萄糖的分解阻遏效应(葡萄糖效应）。(2)延长次级代谢产物的生产时间。与连续培养相比(1)降低了染菌，避免了遗传不稳定性。(2)最终产物浓度较高，有利于产物的分离。(3)使用范围广。缺点：(1)存在一定的非生产时间。(2)由于物料的加入增加了染菌机会。4.补料分批培养应用：1）细胞的高密度培养◇一般培养基中的营养物质浓度有一定的限度，过高的底物浓度会抑制菌体的生长；◇采用补料的方法将高浓度的营养物质逐渐加入反应器，可使发酵液中的菌体浓度达到很高的程度，如大肠杆菌浓度可达145g/L。2）发生底物抑制的过程一些微生物能利用甲醇、乙醇、乙酸、某些芳香族化合物等，但它们在较高浓度下会对菌体的生产产生抑制。应用：面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。3）分解代谢物阻遏◇以某些很容易被微生物利用的物质（如葡萄糖）作为碳源时，其某些分解代谢物会使细胞某些酶的合成受到阻遏；◇采用补料的手段将葡萄糖逐渐加入反应器中，使发酵液中的葡萄糖保持在低水平，避免分解代谢物的积累，从而可以有效去阻遏。4）营养缺陷型菌株的培养一些营养缺陷型菌株可以积累某种有用产物，如氨基酸、核苷、核苷酸等，利用这些菌株进行生产时须补充其不能合成的物质供生产所需；但这些物质过量存在时，可能产生反馈抑制或阻遏作用，影响产物的合成。采用补料的方法可将这些物质保持在低浓度水平，有助于提高产物的生产。柠檬酸合成酶顺乌头酸酶异柠檬酸脱氢酶-酮戊二酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶异柠檬酸裂解酶NH4＋抑制通过细胞膜谷氨酸5）前体的补充◇在一些发酵过程中，加入前体可使产物的生产大大增加；◇但许多前体对菌体有毒性；◇通过补料加入前体既满足产物合成的需要，又不使前体大量积累而产生抑制作用。几个实例：产物补料物酵母菌麦芽汁、氮、磷、镁谷氨酸氨水或尿素柠檬酸铵盐、糖苹果酸葡萄糖淀粉酶葡萄糖青霉素葡萄糖、氨水、苯乙酸不同操作方式菌体及底物浓度随时间变化的情况第二节温度变化及其控制一、温度对微生物生长的影响不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0～260C生长，嗜温菌适应于15～430C生长，嗜热菌适应于37～650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长嗜冷菌在温度10-20℃下生长速率最大嗜温菌在30-35℃生长速率最大嗜热菌在50-60℃生长速率最大嗜高温菌在80-90℃生长速率最大曲线形状相似；当温度增加10℃，生长速率大致增长一倍。当温度超过最适生长温度，生长速率随温度增加而迅速下降微生物产物的生成与微生物的生长一样受温度的影响，但适于生长和适于产物合成的温度不一定相同；必须分别考察，在考虑培养温度时需要采用折中的办法。二、温度对发酵的影响从酶动力学来看，温度升高，反应速率加大，代谢加快，生产期提前；但因酶本身很易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体易于衰老，发酵周期缩短，影响产物的最终产量。如酒精发酵。1）影响产物合成的速率及产量●温度还通过改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成。如粘度、溶氧和传递速率2）影响终产物的质量例如：苏云金杆菌的发酵，一般在30-31℃进行，这样形成的晶体毒力强。若发酵温度提高到37℃以上，虽然菌体生长繁殖较快，最终含菌数也较高，但生物毒力较低，直接影响产品的质量。3）影响生物合成的方向例如：四环素发酵中，金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30℃下，该菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例提高；在温度达到35℃时，则只产生四环素，金霉素的合成停止。三、最适温度的选择最适发酵温度是既适合菌体的生长又适合代谢产物合成的温度。随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变。1、根据菌种选择微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为370C，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30～320C，青霉菌生长温度为300C。2.根据生长阶段选择发酵前期，要尽快得到大量的菌体，需稍高的温度；中期，合成产物，温度要稍低一些，可以推迟衰老，延长合成时间。后期，产物合成能力降低，提高温度，刺激产物合成到放罐。如黑曲霉生长37℃，产糖化酶32～34℃。谷氨酸产生菌生长30～32℃，产酸34～37℃。3、根据培养条件选择通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。4、根据菌生长情况总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。利用计算机模拟确定最佳发酵条件，正逐步得到推广应用。●根据计算机模拟对发酵温度最佳点的计算，得到青霉素发酵的最适温度是：起初5h维持在30℃；随后降到25℃，培养35h；再降到20℃培养85h；最后回升到25℃培养40h放罐。●采用这种变温培养，比在25℃恒温培养青霉素产量提高15%。四、发酵过程引起温度变化的因素——发酵热发酵热：发酵过程中释放出来的净热量。Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显–Q辐射1、生物热Q生物在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。生产菌在生长繁殖过程中本身产生大量的热微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水好氧：产生287.2千焦耳热量，183千焦耳转变为高能化合物104.2千焦以热的形式释放厌氧：产生22.6千焦耳热量，9.6千焦耳转变为高能化合物，13千焦以热的形式释放。2、搅拌热Q搅拌在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：Q搅拌＝P×860×4186.8（焦耳/小时）P——搅拌轴功率4186.8——机械能转变为热能的热功当量影响因素：搅拌器的类型及搅拌速度3、蒸发热Q蒸发通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。4、显热（Q显）排出气体带走的热量叫显热5、辐射热Q辐射发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。Q辐射取决于罐温与环境的温差。一般不超过发酵热的5％。1）菌种特性：好氧、厌氧2）培养基（成分及配比）3）发酵阶段4）搅拌类型及搅拌速度：Q搅拌5）通气速度（影响Q蒸发和Q显）6）罐内外的温差影响发酵温度的因素：由于Q生物、Q蒸发、Q显在发酵过程中随时间而变化，因此发酵热在整个发酵过程中也随时间变化。为了使发酵在一定温度下进行，必须采取措施加以控制。五、温度的控制一般不需加热，因释放了大量的发酵热，需要冷却的情况多。用夹套或蛇形管，通冷却水。夹套（10M3以下）盘管（蛇管）（10M3以上）pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，是十分重要的参数。发酵过程中pH是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否。第三节pH变化及其控制一、发酵过程中pH的变化及影响pH变化的因素1、发酵过程中pH的变化1）生长阶段pH有上升或下降趋势（相对于接种后起始pH而言）如：利福霉素B发酵起始pH为中性，但生长初期由于菌体产生的蛋白酶水解蛋白胨而生成铵离子，使pH上升至碱性；接着，随着铵离子的利用及葡萄糖利用过程中产生的有机酸使pH下降到酸性范围。2）生产阶段在生产阶段，pH趋于