第五章氨基酸工艺学

1第五章氨基酸工艺学2•第一节概述•1.1氨基酸发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种氨基酸的现代工业。氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵。由发酵所生成的产物——氨基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积累是建立于对微生物正常代谢的抑制。也就是说，氨基酸发酵的关键，取决于其控制机制是否能被解除，能否打破微生物正常的代谢调节，人为的控制微生物的代谢。氨基酸发酵的成功，把代谢控制发酵技术引入微生物工业，使微生物工业能在DNA分子水平上改变、控制微生物的代谢，使有用产品大量生成、积累。3•1.1.1氨基酸生产的历史•1820年水解蛋白质开始•1850年在实验室合成了氨基酸•1866年（德）H.Ritthausen（立好生）博士利用硫酸水解小麦面筋，分离到一种酸性氨基酸，依据原料的取材，称之为谷氨酸。•1908年日本制造味之素。•1909年用水解法生产谷氨酸。•1936年（美）从甜菜废液（司蒂芬废液）中提谷氨酸。•1954年多田、中山俩博士报告了直接发酵谷氨酸（L-GA）•1957年发酵法生产味精商业性生产。•4•从20世纪初期，氨基酸实现工业化生产以来，氨基酸生产大体有蛋内质水解法、化学合成法、微生物发酵法和酶法四种生产方法。•蛋白质水解法：早期味精生产、复合氨基酸；•化学合成法：DL-蛋氨酸、甘氨酸、DL-丙氨酸；•酶法：L-丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸；•微生物发酵法：生产60%以上的氨基酸，包括直接发酵法和添加前体发酵法。•前三种方法成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产目的。5•发酵法生产谷氨酸是现代发酵工业的重大创举，也是氨基酸生产的重大革命，同时大大推动了其它氨基酸研究和生产的发展。逐步形成了用发酵法制造氨基酸的新型发酵工业部门。•生产氨基酸的大国为日本和德国。•日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。•日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。6•我国从1958年开始筛选谷氨酸生产菌，同时进行了大量的谷氨酸发酵的基础性研究，1964年分离选育出北京棒状杆菌As1.299和钝齿杆菌As1.542二株谷氨酸生产菌。后进行其它的基础性研究，陆续发表了赖、缬、亮、异亮、色、天冬的发酵研究报告，建立了自己的发酵工业。7•国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。•在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原料都依赖进口。•2000年,世界氨基酸产值达45亿美元,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值可达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。81.2氨基酸发酵生产发展的历史回顾•所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为培养基中的主要原料培养微生物,积累特定的氨基酸。•这些方法成立的一个重要原因是使用选育好的氨基酸生物合成高能力的菌株。9菌株的育种是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之一•从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件.•在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。•随着重组DNA技术的发展,接合、转导、转染、细胞融合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方法构建生产菌株的尝试。•随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。•苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生产。101.2.1用野生株的方法•这是从自然界获得的分离菌株进行发酵生产的一种方法。•典型的例子就是谷氨酸发酵。•改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵111.2.2用营养缺陷变异株的方法•这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生物合成在中途停止，不让最终产物起控制作用。•这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。12谷氨酸棒状杆菌的苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的合成是与分枝途径相联系的(图4-8)，筛选高丝氨酸营养缺陷型后，限量供给苏氨酸时，就能解除由苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制作用，而获得赖氨酸的过量生产。这是因为仅有赖氨酸或苏氨酸存在时，天冬氨酸激酶不被抑制，只有两者的协同效应才能造成抑制。在限量供给苏氨酸的情况下，即使赖氨酸过剩，抑制作用也很难发生。131.2.3类似物抗性变异株的方法•用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。•利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。14高丝氨酸脱氢酶•例如，在黄色短杆菌的赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸生物合成中（图5-16所示），选育抗苏氨酸结构类似物2-氨基-3-羟基戊酸（AHVr）突变株，得到了具有反馈抑制抗性，高丝氨酸脱氢酶活性提高1300倍，能积累14g/L苏氨酸的突变株。151.2.4体内及体外基因重组的方法•基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。•体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体，在两条DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性重组现象。•细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。16•代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础上，应用重组DNA技术可以改变代谢途径分支点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代谢网络。•其主要步骤为:•鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶);•取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点(增强活性或稳定性、解除反馈抑制等);•将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节元件一起克隆进目标生物;•使调节元件的作用及培育条件最优化。通过基因工程技术，构建理想的工程菌株1.2.5基因工程菌171.2.5.1载体-受体系统及克隆表达的研究•1.2.5.1.1受体的获得•目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌K-12及棒状杆菌家族，通常是通过诱变选育出的基础产率较高的菌株。•大肠杆菌遗传背景研究得清楚，载体系统完善，利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将蛋白产物分泌至胞外，为应用带来困难。•棒状杆菌能克服这两个缺点，但载体受体系统研究较晚且有限制修饰系统的障碍，所以获得利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体菌是尚待解决的问题。181.2.5.1.2载体的构建•有效的载体需要有在受体菌中可启动的复制起始位点，这可从棒状杆菌家族内源小质粒中获得;•载体所需的筛选标记及外源基因插入的多克隆位点，可从常用的克隆载体中获得。191.2.5.1.3基因转移手段•由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌，CaCl2转化法对它不适用。•通常采用的方法有:原生质体转化、转导，电转化，接合转移。•原生质体转化的方法是较早采用的方法，由于受到原生质体再生条件的局限，效率不高;•电转化方法由于高效，快速被广泛使用，目前它的转化效率可达到原生质体转化法的100～1000倍。•接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于稳定遗传。201.3氨基酸发酵的代谢控制是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之二•菌种的代谢调控:•控制发酵的条件•控制细胞渗透性•控制旁路代谢•降低反馈作用物的浓度•消除终产物的反馈抑制与阻遏作用•促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成211、控制发酵环境条件–专性需氧菌，控制环境条件可改变代谢途径和产物。222、控制细胞渗透性•生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。•细胞内生物素水平高，Glu不能通过细胞膜•青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞面内外的渗透压而泄露出来。•表面活性剂增加细胞膜通透性氨基酸发酵必须考虑的重要因素23细胞透性的调节细胞透性的调节，一般通过向培养基中添加化学成分（如生物素、油酸、甘油、表面活性剂、青霉素等，达到抑制磷脂、细胞膜的形成或阻碍细胞壁的正常生物合成，使谷氨酸生产菌处于异常生理状态，解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。•生物素：影响磷脂的合成及细胞膜的完整性。•油酸：直接影响磷脂的合成及细胞膜•甘油：甘油缺陷型菌株丧失α-磷酸甘油脱氢酶，不能合成α-磷酸甘油和磷脂。限量供应，控制了细胞膜中与渗透性直接关系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而积累。•表面活性剂：对生物素有拮抗作用，拮抗不饱和脂肪酸的合成，导致磷脂合成不足，影响细胞膜的完整性，提供细胞膜对谷氨酸的渗透性。•青霉素：抑制细菌细胞壁的后期合成，形成不完整的细胞壁，使细胞膜失去保护，使胞内外的渗透压差导致细胞膜的物理损伤，增大谷氨酸向胞外漏出的渗透性24生物素阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成表面活性剂对生物素有拮抗阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成在对数生长期添加青霉素抑制细胞壁合成细胞膜损伤甘油缺陷型磷脂的合成受阻影响细胞膜的合成油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成影响细胞膜的合成提高细胞膜的谷氨酸通透性控制磷脂的合成使细胞膜受损（如表面活性剂）青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜控制磷脂含量通过油酸的合成通过甘油合成直接控制磷脂合成253、控制旁路代谢264、降低反馈作用物的浓度•利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸的量。限制瓜氨酸的浓度可解除反馈抑制，实现鸟氨酸的生物合成。275、消除终产物的反馈抑制与阻遏作用–使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法或者通过选育营养缺陷型菌株。6、促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成•ATP的积累可促进氨基酸的生物合成28•迄今，日已有22种氨基酸可用发酵法生产。•但生产上不一定非用生物合成。根据经济、资源的合理性，利用不同方法生产氨基酸。如蛋氨酸、鸟氨酸用化学合成法，胱氨酸可用提取法水解。但化学合成为D型，右旋。生物合成为L型，左旋。水解法污染厉害。因而总的来说，氨基酸生产要用生物合成。29•今后的发展是育出从遗传角度解除了反馈调节和遗传性稳定的更理想菌种。提高产酸。采用过程控制，加强种子管理、连续化、自动化、稳产高产、探索新工艺、新设备，以提高产率和收得率、研究微生物生理、生化、遗传变异和发酵机制等问题，以便能更好地控制氨基酸这样微生物中间代谢产物的发酵。30•二、氨基酸的应用•（一）医药•因为蛋白质是由各种氨基酸构成的，所以各种氨基酸及其衍生物可治疗各种不同的疾病。•如消化系统经手术后，或烧伤、创伤病例需大量补充蛋白质营养时，可注射各种氨基酸，配比接近鸡蛋的配比为佳。八种必须氨基酸（异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）•苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。31•（二）食品•1．调味用的氨基酸•①味精（Glu-Na）•其与肌苷酸钠或鸟苷酸钠同时使用，具协同作用，可提高鲜味。•②天冬氨酸钠•用量仅次于味精的调味品，具强烈鲜味。•③甘氨酸•甜味为砂糖的0.8倍。在果汁中加0.02%～0.4%的甘氨酸，可去除糖精的苦味。32•④DL-丙氨酸。甜味为砂糖的1.2倍。•⑤D-色氨酸。甜味为砂糖的35倍。用于牙膏、糖尿病人及肥胖病人。•⑥天冬氨酸-苯丙氨酸甲酯。甜味为砂糖的150倍。但其水溶液不耐热，70～80℃就分解，加热至100℃就失去甜味。•2．提高食品的营养价值。•8种人体必须氨基酸，不能在体内合成，而各种食品又缺乏某一特定的必须氨基酸，添加之可提高蛋白质的利用率。如。鱼缺色氨酸。•强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中)33•（三）农业•1．增加饲料的营养率。•如，谷类缺赖氨酸，豆类缺蛋氨酸。•甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料。•2．氨基酸农药•如