第六章_发酵条件及工艺控制

发酵工艺控制第六章目的要求：•了解发酵类型及其发酵规律。•掌握发酵控制、产物检测的方法，以保证发酵正常进行，获得高效产品。•熟悉发酵工业的逐级放大过程。•了解发酵过程的优化原理。几个问题•1、发酵的类型•2、发酵的规律•3、发酵的控制•4、发酵中所用的检测方法•5、发酵过程的逐级放大定义发酵过程：即微生物细胞的生物反应过程，是指由微生物生长繁殖所引起的生物反应过程。它不仅包括了以往“发酵”的全部领域，而且还包括固定化细胞的反应过程、生物法废水处理过程和细菌采矿等过程。为什么要研究发酵过程？微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来。为此我们必须通过各种研究方法了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础。同时，为了掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律，可以通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度，糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度pH、溶解氧等参数的情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境之中，过量产生代谢产物。本章内容：•第一节发酵工程常见的主要发酵类型•第二节发酵工艺的控制•第三节发酵的优化控制•第四节发酵过程的计算机控制•第五节发酵工业的逐级放大•第六节发酵过程的参数检测第一节发酵工程常见的主要发酵类型(p24-39)•一、液体发酵与固体发酵•二、厌氧发酵与好氧发酵•三、分批发酵与连续发酵•四、单一发酵与混合发酵•五、固定化发酵技术采用哪种发酵方式？（p25）•在微生物发酵工业生产中，究竟应该采用什么方式进行发酵主要取决于以下几点：•菌种特性、原料特点、产物特色、设备状况、技术可行性、成本核算等。•一般各种发酵方式往往是结合进行的。•现代发酵工业主要的发酵方式：好氧、液体、深层、分批、单一纯种发酵方式结合进行的。•优点：p25一、液体发酵与固体发酵•（一）液体发酵（也叫液体培养）p25•是指将微生物接种到液体培养基中进行培养的过程。•如采用液体培养时利用的是好氧微生物则需要培养液中有较高的溶解氧。1、实验室常见的液体发酵方式•实验室常见的好氧液体发酵方式：•试管液体培养•浅层液体培养•摇瓶培养：装液量为三角瓶的10%以下，如250mL的三角瓶装量为10～20mL培养液。•台式发酵罐：发酵罐的体积为几升至几十升。•液体厌氧培养方式：•在厌氧罐中进行。•在培养基中添加还原剂。•为满足微生物的厌氧需要采取的措施：•培养基中添加有机还原剂（巯基乙醇、半胱氨酸）、无机还原剂（铁丝）。•使培养基的氧化还原电位在﹣429～﹣150mV。2、工业生产中常见的液体发酵方式p27•静置培养（浅盘培养）：容器中盛装浅层培养液进行静止培养。•通气培养（发酵罐深层培养）：在发酵罐中加入液体培养基，通入无菌空气并搅拌，进行微生物发酵的方式。•厌氧发酵：在发酵罐中加入液体培养基不需通入无菌空气，进行微生物发酵的方式。（二）固体发酵(p28-30)•固体发酵（固体培养、固态发酵）•就是利用固体培养基培养微生物的方法。1、固态发酵概述•固体发酵：•也称固态培养，是利用固体培养基进行微生物的培养。•应用:•固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和保藏等方面发挥着重要作用。•固态发酵主要是一些传统发酵工艺。例如生产大曲酒、麸曲酒就是典型的固态发酵。一些丝状真菌可以进行生产规模的固体发酵。•固态发酵的一般过程：•原料预处理，蒸煮灭菌，接种，固态发酵，发酵结束及时后处理。•固体发酵的形式：•好氧、厌氧•厚层，25～30cm厚的物料。如曲池、曲箱等。•薄层，1～2cm厚的物料。帘子、曲盘等。2、实验室常见的固体培养形式：试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面。用途：菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。方法：（1）用接种环挑取原始培养物后，在固体培养基表面划线接种（2）用涂布棒将少量的液体培养物涂布在整个固体培养基表面（3）将少量液体培养物与融化后降温至50～60℃的固体培养基混匀，倒入培养皿中，浇注成平板。（4）接种后的培养物直接放入培养箱中恒温培养。这些方法适用于好氧和兼性好氧微生物的培养。3、生产中常见的固体培养•（1）好氧固体培养•方法：在生产实践中，好氧真菌的固体培养方法都是将接种后的固体基质薄薄地摊铺在容器的表面，可使菌体获得充足的氧气，又可以将生长过程中产生的热量及时释放。•特点：固体培养使用的基本培养基原料是小麦麸皮等。灭菌后待冷却到合适温度便可接种。固体培养基中的含水量控制在40％～80％之间（典型的液体培养基含水量在95％以上）。•细菌和酵母菌将无法忍受如此低水含量的环境，所以，固体培养被细菌或酵母菌污染的可能性大大降低。•发酵形式：•厚层：25～30cm厚的物料。如曲池、曲箱等。•薄层：1～2cm厚的物料。帘子、曲盘等。•产品：•麸曲、食用菌、酱油、米酒。•（2）厌氧固体发酵•我国传统白酒的生产采用的是大型深层地窖堆积式的固体发酵。•酵母菌是兼性厌氧菌。4、固态发酵特点•边糖化边发酵：一般都采用比较低的温度，让糖化作用和发酵作用同时进行；即采用边糖化边发酵的工艺。当采用20～30℃低温时，糖化酶作用缓慢，故糖化时间要延长。•多菌种的混合发酵。除原料蒸煮过程能起到灭菌作用外，空气、水、工具和场所，窖池等都存在大量的多种多样的微生物，并把这些微生物带到发酵原料中，它们与曲中的微生物一起协同作用，生产出丰富的香味物质，如固体厌气发酵。•开放式发酵，无菌程度要求不高。在霉菌发酵时就可以防止污染杂菌。•设备简单。•生产成本低、能耗低。•原料来源广，价格低廉。•固体发酵的产物回收一般步骤少，费用也省。•缺点：•发酵时间长•耗费劳动力多•占地面积大•生产规模难以扩大•pH、溶氧和温度难以控制•固体发酵存在的主要工程问题是大规模生产时的散热比较困难，参数检测如pH值、温度、菌体增殖量、产物生成量等是很难实现的。因此，实现固体发酵的最优化困难重重。5、固态发酵的控制•（1）固态发酵的温度控制•固态发酵的温度控制靠控制进窖温度和淀粉含量来解决。因在窖内部没有冷却或加热装置，这样只好把进窖温度控制得比较低(18～22℃)。糖化进行缓慢，发酵也就缓慢，窖内升温慢些，酵母就不易衰老，发酵率就升高。进窖时原料淀粉含量不能太高，在发酵过程中一部分能量被放出，升高了发酵温度。•一般发酵过程中，淀粉含量每降低1.0％时，酒醅温度实际约上升2℃左右。•所以淀粉含量控制在14～16％，随气温的高低不同进行适当的调整。(2)固体发酵的pH控制•一般工厂用酸度表示。•酸度来源：原料本身，曲和酒醅是最主要的。•发酵过程中酸度增加的原因：主要是杂菌的影响，淀粉浓度过高，糖化快，细菌生长繁殖快，造成酒醅酸度升高，也反过来影响酵母的生长，影响发酵，酸度低又影响糖化速度。•控制原因：控制酸度既适宜酵母生长又抑制了细菌生长。•控制程度：一般控制pH在1.4～2.0的酸度。(3)水分的控制•固体发酵中水分的作用：水分是微生物生长的条件，适当的水分是良好发酵的重要因素。但入窖水分过高，会引起糖化和发酵作用加快，升温过猛，使发酵不彻底；而水分过少，会引起酒醅发干，残余淀粉高，酸度过低，槽不柔软，影响发酵正常进行。•控制措施：一般大曲酒入窖水分为53～57％，小曲57～62％，因原料而异，冬天与夏天也不同。•其他控制措施：另一方面为了调整淀粉浓度，增加疏松性，调节酸度，以利于微生物的生长繁殖，保持水分，在固态发酵时常常加入填充料、如谷壳等。二、厌氧发酵与好氧发酵(p30)•厌氧培养：•深层培养•好氧培养：•液体表面培养、固体培养、通氧深层培养（一）厌氧液态发酵•厌氧发酵也称静置培养：是利用厌氧微生物在液体状态下进行的发酵。•特点：液体发酵速度快，发酵完全，发酵周期短，原料利用率高，而且适于大规模机械化、连续化、自动化生产。•液态厌氧发酵对无菌要求较高，因此培养基必须经过灭菌，对发酵容器也要定期灭菌。•接种量大，在发酵过程中对pH、温度进行连续控制，中间分析也与好氧发酵相似。•应用：酒精、丙酮、丁醇、乳酸、啤酒等发酵。三、分批发酵与连续发酵（p31～37）•（一）分批发酵•（二）补料分批发酵•（三）连续发酵■深层发酵按进行过程可分为：分批发酵(Batchfermentation)补料分批发酵(Fed-batchfermentation)连续发酵(Continuousfermentation)1、分批发酵的定义•是指在一封闭系统内将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，经过一段时间后将整个反应物取出的发酵方式。•在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。•发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。•它是发酵工业中常见的一种方法。（一）分批发酵（p31-33）2、分批发酵的特点•微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。•微生物处在限制性培养基中，只能在有限时间内维持微生物的增殖，其生长表现为典型的生长周期。•发酵周期：包括空罐灭菌、加入灭菌过的培养基、接种、发酵过程、放罐和洗罐所需的整个时间。●优点●操作简单；●操作引起染菌的概率低。●不会产生菌种老化和变异等问题。●缺点●非生产时间较长、设备利用率低。●生长到一定程度就要受到抑制（原因：基质抑制或产物抑制）。3、典型的分批发酵工艺流程（二）补料分批发酵（p33-34）1、定义●又称半连续发酵或流加分批发酵：是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。•即在分批培养伊始，投入较低浓度的底物，然后在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内，以维持微生物的生长和产物的形成，并避免不利因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度和产物得率的目的。2、补料分批发酵的优缺点•优点–使发酵系统中维持很低的基质浓度，可以解除底物抑制、产物抑制和葡萄糖的分解阻遏效应；（可以除去快速利用碳源的阻遏效应、避免培养基积累有毒代谢物。）–和连续发酵比、不需要严格的无菌条件；–不会产生菌种老化和变异等问题。–维持适当的菌体浓度，减少通风设备的压力，避免分批发酵初始阶段供需氧量大的问题。•缺点–存在一定的非生产时间；–和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。–分批补料系统并不连续地向罐外放出发酵液，因而发酵罐内的培养基体积不再是个常数，而是随时间和物料流速而变化的变量。3、适用范围•培养基成分的浓度显著影响菌体和产物得率的发酵，利用此发酵方式可减轻高底物浓度的抑制作用，有利于更多产物的生成。•受到分解代谢物阻遏的发酵。•营养缺陷型菌株的培养。（流加该菌株所需的物质，不至于过量而产生反馈抑制或阻遏）•前体的补充。（可以避免前体对细胞的毒害）•目前补料分批发酵广泛应用于抗生素、氨基酸、酶蛋白、核苷酸、有机酸、色素及高聚物等的生产。•液体发酵、固体发酵、混合发酵。•4、补料量和补料率的确定•目前生产中还只是凭经验。•根据检测的静态参数如基质残留量、pH值、溶氧浓度等。5、补料分批发酵的类型•补料方式–连续流加–不连续流加–多周期流加•补料成分–单一组分流加–多组分流加•控制方式–反馈控制（以DO值为反馈指标等）–无反馈控制•发酵过程中不同的补料方法对微生物细胞的密度、生长速度以及产率都有影响。•参见p34表1-5（三）连续发酵（p34-37）1、定义●1、定义●连续发酵：新鲜培养基料液连续输入发酵罐，并同时以相同速度放出含有产品的发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。•是在开放系统中进行的。2、连续发酵的优缺点•优点（p35）–能维持低基质浓度。–缩短发酵周期，提高设备利用率和单位时间的产量。增