超声波辅助盐析提取猪小肠中肝素的工艺

第26卷第5期农业工程学报Vol.26No.52010年5月TransactionsoftheCSAEMay2010379超声波辅助盐析提取猪小肠中肝素的工艺张丽萍1,2，宋大巍2，马中苏1※（1．吉林大学生物与农业工程学院，长春130022；2．黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，大庆163319）摘要：为研究超声波处理对肝素提取效果的影响，并找出最佳的处理技术参数。采用商业屠宰猪的小肠，用超声波辅助盐析法提取肝素，在超声功率、超声时间、超声温度和液料比4个单因素试验的基础上，采用四因素二次正交旋转组合设计来优化工艺参数。试验结果表明，在超声功率300W，超声温度40℃，超声时间40min，液料比为15mL/mg条件下肝素得率最高，达到0.0184%，比盐析法的得率提高了10%以上，节省提取时间2h左右。试验结果表明，超声波技术在肝素提取工艺中具有较高的应用价值，可作为一种新型工艺技术进行推广。关键词：超声波，提取，优化，技术参数，肝素doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2010.05.065中图分类号：O658.9，S872文献标识码：A文章编号：1002-6819(2010)-05-0379-06张丽萍，宋大巍，马中苏.超声波辅助盐析提取猪小肠中肝素的工艺[J].农业工程学报，2010，26(5)：379－384.ZhangLiping,SongDawei,MaZhongsu.Processofheparinextractionusingultrasonicassistedsaltingout[J].TransactionsoftheCSAE,2010,26(5):379－384.(inChinesewithEnglishabstract)0引言肝素是一种由艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸双糖重复单位组成的酸性黏多糖，主要是通过肝素和抗凝血酶的结合产生抗凝血功能[1-2]。学者对肝素的深入研究过程中发现，肝素不但有抗凝血、抗血栓形成的作用，还有抗炎、抗过敏等生物学功能[3-4]。肝素是一种资源依赖型产品，主要原料是猪肠黏膜和牛肺，在小肠黏膜细胞内的含量最高。中国是生猪资源大国，具有丰富的畜产品副产物资源，肝素原料资源最为丰富，以猪肠黏膜为原料生产的肝素抗凝活性高于牛肺肝素，在国际市场上更受欢迎。中国是世界上肝素主要出口国家之一，但出口产品以低效价的粗品肝素为主。原因是中国生产肝素精制品技术还不过关，存在着产品效价低、提取率低及精制技术不成熟等问题[5-6]，每年要从国外大量进口精品肝素。针对中国目前肝素利用、生产技术存在的问题，研究高效提取和分离纯化肝素技术，具有重要意义。中国畜禽加工副产物资源极为丰富，每年生猪屠宰量2亿头以上，仅猪内脏一项每年就达200万t，其中猪小肠年产量约50万t；每年肉牛屠宰量达到4400万头，其中牛肺的年产量约20万t。但是，目前中国畜禽内脏的利用率还很低，大部分以食品的形式出售和加工。在中国大量畜禽副产物未被充分利用且畜禽副产物提取利用技术水平落后的背景下，提出肝素提取纯化新工艺及收稿时间：2009-12-12修订时间：2010-02-20基金项目：黑龙江省“十一五”重点项目（GB06B403-3）作者简介：张丽萍（1957－），女，吉林长春人，博士生，研究员，农副产物综合利用研究方向。长春吉林大学生物与农业工程学院，130022。Email:[e-mail]※通信作者：马中苏（1952－），男，教授，博士生导师，农产品保藏与微环境调控研究方向。长春吉林大学生物与农业工程学院，130022。Email:[e-mail]降解后的生物活性研究，可以大大提高畜产品加工副产物的附加值，对于黑龙江省以及全国的肉类加工企业都具有很好的应用前景。国内外传统上采用盐析提取肝素，并结合离子树脂交换进行肝素吸附分离[7]。然而这种方法具有提取率低、提取时间长、溶剂消耗多、污染环境等问题[8]。超声波技术是利用热力学，机械震动和空化作用产生的协同效应起作用的。超声机械震动能产生和传送很高的能量来破坏细胞结构，并且使可溶性物质产生很高的速度，加速进入震动状态[9]。超声的空化现象产生的剪切力能够破坏细胞结构，并且提高传质系数[10]。超声提取技术作为一种新兴技术，被广泛应用在从植物和水果原料中提取功能成分[11-13]，以及从草药中提取生物活性组分[14-17]。与传统方法相比，超声提取技术能够提高目标组分的提取率。有些学者研究将超声技术应用在畜产品加工领域，比如超声波处理对鸡肉的理化性质、适口性和风味的影响[18-23]。但是很少有将超声技术应用到畜禽副产物综合利用方面的研究，目前尚没有利用超声波辅助从猪小肠中提取肝素的报道。为了综合利用畜产品加工副产物，增加猪小肠肝素得率，本研究首次将超声技术应用在肝素提取工艺中，同时利用SAS软件分析优化提取的条件和参数[24]。1材料与方法1.1试验原料新屠宰的20付猪小肠（购自大庆市农贸市场），采用Warda描述的方法处理原料[25]。将新鲜猪小肠立即加入0.125mol/L的亚硫酸氢钠作为抗氧化剂保存，放在干冰上用密封的盒子包装运输到实验室，然后储存在实验室-70℃冰箱里备用。猪小肠肝素标准品（购自中国药物生物检定所，北京）；胰蛋白酶（购自北京奥博星生物技术责任有限公司）；其他试剂均为市售（分析纯）。380农业工程学报2010年1.2试验方法1.2.1盐析提取肝素将10g猪小肠（新鲜猪小肠去内容物）切成小块，放在JJ-2B组织捣碎机匀浆（荣华设备有限责任公司，中国），将匀浆液移入封口的三角瓶中（250mL）。向三角瓶中加入150mL蒸馏水搅匀，调节溶液至pH8.5，再加入6gNaCl粉末进行盐析提取。盐析时控制温度为55℃，盐析4h。盐析提取后，将粗提取物在4℃、4000r/min下离心30min（LGR10-4.2离心机，北京医用离心机厂，中国），过滤后用浓硫酸氧化法测肝素浓度。1.2.2超声波处理辅助盐析提取肝素同盐析法的前处理，将10g新鲜猪小肠去内容物切成小块，放在组织捣碎机匀浆，然后将匀浆液移入封口的三角瓶中（250mL）。向三角瓶中加入150mL蒸馏水搅匀，调节溶液至pH8.5，按照表1中的设计，在间歇式超声处理机中进行超声处理（JBT/C-YCL400型超声波药品处理机，济宁金百特电子有限公司）。超声后的料液加入NaCl粉末，分别调节NaCl质量浓度为30、40和50g/L，进行分级盐析提取1h。盐析提取温度控制在55℃（DK-450B型电热恒温水浴锅，上海森信试验仪器有限公司，中国）是通过将三角瓶浸入自动控温的水浴锅中进行控制的。提取后，将粗提取物在4℃、4000r/min条件下离心30min，过滤后采用浓硫酸氧化法测肝素浓度。每组试验重复3次，取平均值。1.2.3咔唑法分析肝素含量采用咔唑分析来检测制备的肝素中糖醛酸的含量，这种方法对Bitter和Muir的方法进行了简单改进，在298nm检测肝素样品的吸光度[26]。使用猪小肠肝素标准品来制作标准曲线，提取液中的肝素的质量分数，可以根据标准曲线方程进行计算。肝素的得率可以根据公式（1）进行计算。100%提取肝素质量肝素得率原料质量（1）1.2.4单因素试验单因素试验项目包括：液料比对肝素得率影响试验，超声功率对肝素得率影响试验，超声时间对肝素得率影响试验，超声温度对肝素得率影响试验。液料比对肝素得率影响试验：设定蒸馏水与小肠黏膜匀浆料的液料比5、10、15、20、25、30、35mL/mg7个水平组，在超声温度40℃、超声功率300W、超声时间40min条件下处理；超声功率对肝素得率影响试验：选择100、150、200、250、300、350、400W7个水平组，在液料比15mL/mg、温度为40℃、超声时间40min条件下处理；超声时间对肝素得率影响试验：选取20、25、30、35、40、45、50min7个水平组，在液料比15mL/mg、超声温度40℃、超声功率300W条件下处理；超声温度对肝素得率影响试验：设置超声温度为20、30、40、50、60、70、80℃7个水平组，在液料比15mL/mg、超声时间40min、超声功率300W条件下处理。以上各组超声处理后经过滤、离心，检测肝素得率。每组试验重复3次，取平均值。1.2.5二次正交旋转组合优化试验在单因素试验结果的基础上，以液料比、超声功率、超声时间、超声温度为考察变量，以肝素得率为响应值，采用二次旋转组合设计方案，用以优化超声波处理猪小肠黏膜提取肝素的工艺参数。共设计了36组试验，每组试验做3个平行样，其因素水平编码见表1。利用SAS8.2软件对试验数据进行统计分析，以获取最适工艺参数。表1因素水平及编码表Table1Tableoffactorlevelsandcoding水平X1液料比/(mL/mg)X2超声功率/WX3超声时间/minX4超声温度/℃25200252011025030300153003540-1203504050-22540045601.2.6肝素提取物的红外光谱分析采用红外光谱检测肝素的结构[27]。取2.0mg猪小肠肝素标准品或提取物与200mgKBr进行混合压片。用傅里叶变换红外光谱仪对压片进行波长扫描，频率透射光谱在4000～400cm-1频率范围内进行检测。设置傅里叶变换红外光谱仪的DTGS（deuteratedtriglycinesulfatide，氘化三甘氨酸硫酸脂）检测器的分辨率为4cm-1，每个样品进行200次扫描，将平均值累加。2结果与分析2.1盐析法提取肝素结果将处理好的猪小肠黏膜采用盐析法提取肝素，在55℃条件下盐析4h后，经过离心过滤后用浓硫酸氧化法测肝素浓度。最终肝素的得率为0.0165%。2.2超声功率对肝素得率的影响图1表明在不同超声功率下猪小肠提取肝素得率。通过分析图1的趋势可知，当超声波功率在100～150W时，肝素得率较低；当超声波功率在150～300W时，肝素得率随着超声波功率的增加而逐渐提高，超声功率在300W时肝素得率达到最高点0.0183%；当超声功率在300～350W时，肝素得率略有下降。注：液料比15mL/mg，超声温度40℃，超声时间40min图1超声功率对肝素得率的影响Fig.1Effectsofultrasonicpoweronheparinyield第5期张丽萍等：超声波辅助盐析提取猪小肠中肝素的工艺381由于肝素是细胞内的主要组分，在超声处理条件下肝素能很快通过破坏的细胞膜溶解出来。当超声功率很低时，超声没有达到声强的阈值，很难产生空化作用。当超声功率达到200W以上时则产生了空化作用，肝素得率增加[28]。但超过300W的超声功率可能产生空化气泡塌陷，破坏了肝素的基本结构，导致肝素的分解，使肝素得率下降[29]。这与He等对大蒜素提取的研究结果类似[30]。2.3超声温度对肝素得率的影响图2是在不同超声温度下猪小肠提取肝素得率。当超声温度为20～25℃时，肝素得率较低；当超声温度升至25℃以上时，肝素得率开始逐渐提高，在40℃时肝素得率最高；超声温度在40～50℃时，肝素得率逐渐下降。注：液料比15mL/mg，超声时间40min，超声功率300W图2超声温度对肝素得率的影响Fig.2Effectsofultrasonictemperatureonheparinyield试验表明，超声温度在40℃和45℃之间较为适宜。较高的温度可能会导致肝素的分解和活性损失，而且随着温度的升高，还会导致溶剂挥发加速、能耗增加等问题。2.4超声时间对肝素得率的影响图3是不同超声时间下猪小肠提取肝素得率。由图3可以看出，当超声时间在20～40min范围内，肝素得率随着超声时间的延长而增加。当超声时间达到40min时，肝素得率最高。当超声时间超过40min，肝素得率不再增加。分析认为，随着超声时间的延长，被提取组分的溶解量增加，所以肝素得率增加。当提取率达到一定阈注：液料比15mL/mg，超声温度40℃，超声功率3