机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维细胞的

第二军医大学博士学位论文机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维细胞的蛋白组学研究姓名：张伟申请学位级别：博士专业：@指导教师：陈德玉2011-03第二军医大学博士学位论文-6-机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维细胞的蛋白组学研究摘要目的颈椎后纵韧带骨化（ossificationofcervicalposteriorlongitudinalligament,OPLL）是以颈椎后纵韧带异位骨化为特点的一种疾病，在骨化过程中伴随着脊髓和神经受压，导致患者出现四肢感觉运动及大小便功能障碍等临床症状，严重的影响患者的生活质量，在以日本为首的亚洲国家中具有较高发病率，其具体的发病机制目前并不完全清楚。最新临床研究发现，OPLL患者行颈椎后路椎管成形术或者后路椎板切除术后，颈椎稳定性下降，活动度增加，随访期间发现患者的骨化进展速度较未手术患者明显加快；而OPLL患者行前路减压融合术后，因为病变节段活动度消失，骨化进展明显减慢或完全消失。同时，机械应力刺激因素在动物实验得到进一步证实：对大鼠尾端椎体进行牵张应力刺激2周后即发现大鼠近端椎体韧带出现明显骨化倾向。因此，可以肯定局部机械应力刺激是促进韧带异位骨化发生、发展的一个极其重要的环境因素。蛋白质组学（Proteomics）的概念自20世纪90年代后期提出以后，作为后基因组学时代的研究工具，在蛋白质组表达、蛋白质功能研究中发挥越来越大的作用，对发现疾病标志物、药物靶点的确证等方面有着十分重要的意义。差异凝胶电泳(DIGE)是对2-DE在技术上的改进，该技术结合了多重荧光分析的方法，通过花青染料的荧光素蛋白质中的赖氨酸残基进行结合，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入内标的概念。该技术可以使样本间的差异蛋白质点显示更加容易、更加准确，可以发现更多表达差异的蛋白质点。随后利用MALDI-TOF/TOFMS质谱技术以及肤质量图谱(pePtidemassfingerprint，PMF)等多种数据的组合来确定可靠的蛋白质。本研究采用蛋白组学研究方法，通过荧光差异凝胶电泳（differentialgelelectrophoresis,DIGE）及质谱技术筛选并鉴定颈椎后纵韧带成纤维细胞在机械应力诱导骨向分化过程中表达差异的蛋白质，并通过生物信息学分析，获得蛋白质水平上关于疾病发生过程的整体而全面的认识，分析多个细胞内信号传导途径在疾病发生过程中所起的作用，期望找到机械应力在颈椎后纵韧带骨化发生、发展过程中相关的细胞信号分子蛋白，探讨力学刺激在颈椎后纵韧带骨化发展过程中的可能的病理学和分子机制，为临床OPLL的治疗提供可能的药物靶点。机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维细胞的蛋白组学研究-7-方法我院骨科从2009年3月至2010年4月共收治12例颈椎后纵韧带骨化患者，全部病例行颈椎前路椎体次全切除减压、植骨融合内固定术，术中获得患者后纵韧带组织，另外收集10例非骨化患者的颈椎后纵韧带骨化组织（颈椎病2例，颈椎外伤8例），采用组织块贴壁法培养、鉴定骨化与非骨化后纵韧带成纤维细胞。将传至第3代的成纤维细胞（骨化组与非骨化组）接种于6孔培养板内，贴壁后同步化24小时，采用Flexercell4000应力加载系统对细胞施加10%-0.5Hz的机械应力，持续加载24小时，以同样种于Flexercell板未施加机械应力为对照组（骨化组与非骨化组），采用半定量RT-PCR技术检测机械应力诱导前后三个成骨特异指标骨钙素（OCN）、碱性磷酸酶（ALP）及I型胶原（COLI）表达量的差异，明确成纤维细胞经机械应力诱导后有无发生骨向分化。DIGE裂解液、超声破碎抽提骨化组细胞的总蛋白质样本，普通2-DE双向凝胶电泳分离，染色鉴定成纤维细胞蛋白质样本的量及确定电泳条件是否满意。然后加大上样量，以Cy2、Cy3及Cy5荧光素标记机械应力诱导前后的成纤维细胞蛋白样品各50μg，以所有样本的混合物50μg作为内参，进行双向荧光差异凝胶电泳（DIGE）。获得荧光差异表达图谱，利用DeCyder6.5图谱软件进行胶内及生物学差异分析，确定差异表达的蛋白质点。挑取差异表达的蛋白点，手工切胶后酶解以获得肽段样本。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（matrix-assistedlaserdesorptionionization-time-of-flightmassspectrum,MALDI-TOF/TOFMS）进行鉴定并分析差异表达的蛋白质点。查阅相关参考文献，总结分析相关表达差异蛋白质的分子量、功能及细胞内的分布，推测其在OPLL进程中的可能作用及机制。选择有深入研究价值的蛋白-波形蛋白，采用WesternBlotting技术从蛋白水平进一步验证DIGE和质谱技术筛选出来差异蛋白质表达水平差异的准确性。然后利用RNAi干扰技术，阻断波形蛋白的表达，再采用半定量RT-PCR技术检测机械应力诱导前后三个成骨特异性指标骨钙素（OCN）、碱性磷酸酶（ALP）及I型胶原（COLI）表达量的差异，进一步验证波形蛋白是否在OPLL韧带成纤维细胞骨化进程中的重要作用，深入探讨其在力学因素诱导OPLL骨化中可能的分子机制。结果利用组织贴壁法成功的培养了骨化与非骨化颈椎后纵韧带成纤维细胞，经鉴定确认细胞为成纤维细胞。机械牵张应力可诱导来源于颈椎颈椎后纵韧带骨化患者的韧带组织成纤维细胞发生骨向分化，RT-PCR确认成纤维细胞经机械应力诱导后成骨特异性标记物OCN、ALP、COLI表达量明显增高，而对于来源于非骨化患者的颈椎后纵韧带组织成纤维细胞却无相应作用，诱导前后OCN、ALP、COLI未见明显变化。提取骨化组后纵韧带成纤维细胞牵拉组和对照组细胞的总蛋白，然后行普通2-D第二军医大学博士学位论文-8-电泳实验，染色后得到的图谱显示蛋白质丰度、分离情况及电泳条件满意。荧光差异双向凝胶电泳（DIGE）获得的荧光胶图，胶间比较共筛选出34个差异表达蛋白质点，其中4个蛋白质在表达上调，30个蛋白质点下调；最大上调比例为1.58倍；最大下调比例为5.47倍。选择的标准为丰度具有显著性改变（比值1.2倍，P0.05)的蛋白质点被从考染的制备胶上切下用于质谱分析。手工切胶获得蛋白质点的肽段样本，采用MALDI-TOF/TOFMS质谱技术成功鉴定了15个表达差异的蛋白，其中14个表达下调，1个表达上调。查阅相关文献，根据这些蛋白质的功能分为以下几类：代谢酶类、蛋白质翻译相关蛋白、细胞骨架蛋白和其它相关蛋白。多种蛋白质发现与骨化相关，选择可能在OPLL发生和发展过程中起关键作用的蛋白-波形蛋白（Vimentin）行进一步验证，通过Westernblotting技术验证了DIGE的实验结果，并通过RNAi实验进一步验证了其在OPLL韧带成纤维细胞骨化进程中的重要作用。结论组织块培养法可成功进行颈椎后纵韧带成纤维细胞的培养。机械应力刺激诱导OPLL组后纵韧带成纤维细胞后OCN、ALP及COLI的高表达说明机械应力刺激在后纵韧带骨化进展过程中的促进作用。通过DIGE及质谱技术筛选并鉴定成纤维细胞在机械应力诱导后表达差异的蛋白质，建立了比较蛋白质组学在OPLL发病过程中研究的技术路线。通过RNAi干扰试验发现波形蛋白在颈椎后纵韧带骨化症发展中有重要的调控作用。关键词后纵韧带骨化症；机械应力；双向凝胶电泳；质谱；成纤维细胞；波形蛋白机械应力诱导颈椎后纵韧带骨化进展过程中成纤维细胞的蛋白组学研究-9-ProteomicAnalysisofOsteogenicDifferentiatedFibroblastofCervicalPosteriorLongitudinalLigamentalInducedbyMechanicalStressAbstractOBJECTIVEOssificationofcervicalposteriorlongitudinalligamentwascharacterizedbyectopicspinalligamentossificationandatthesametimespinalcordandnervecompression,resultinginpatientsfunctionaldisorderoflimbsandbowelandbladderdysfunction,whichaffectedthequalityoflifeofpatientsseverely.ThediseasewaspopularinAsian,especiallyinJapan,andthepathogenesiswasnotfullyunderstood.Clinicalstudyfoundthatcomparedwithbefore-surgery,theprogressoftheossificationofthecervicalposteriorlongitudinalligamentweresignificantlyacceleratedbecauseofdecreasedcervicalstabilityandincreasedcervicalmotionafterlaminectomyandlaminoplasty.However,theprogressofossificationofthecervicalposteriorlongitudinalligamentsloweddownordisappearafteranteriorapproachforOPLL,becausethemotionofcervicalsegmentdisappearedafterthefusionsurgery.Meanwhile,thattheproximalvertebralligamentshowsignificantossificationtendencyafterthemechanicalstressstimulitherattailvertebraefor2weeksconfirmedthefactthatmechanicalstresshadimportantroleinossificationofthecervicalposteriorlongitudinalligament,andwasanextremelyimportantenvironmentalfactors.Proteomicsusedthecompleteproteinofcellortissueastheresearchobject,themethodprovidedanewmeansofdetectionofdiseasemarkers,thedisease-causingprotein,drugtargetsandsoandhasagreatsignificancemeanings.Inthisstudy,thesedifferentiallyexpressedproteinsoffibroblastofthecervicalposteriorlongitudinalligamentinducedbymechanicalstresswerescreenedandidentifiedbyfluorescencedifferencegelelectrophoresisandmassspectrometry,andanalysistheproteinlevelontheoveralldiseaseprocessbyBioinformaticstechnique,fundtheeffectoftheseproteininthecomprehensivemultipleintracellularsignaltransductionpathway,第二军医大学博士学位论文-10-understandingthepathogenesisofmechanicalstressintheprocessesofOPLL,improvedthepos