发酵设备及消毒灭菌

L/O/G/O第三节发酵设备及消毒灭菌发酵的一般流程种子扩大培养培养基配制空气除菌培养基灭菌发酵生产下游处理发酵设备发酵设备——发酵罐发酵罐的特点轴封严密，泄漏少能承受一定压力、温度搅拌通风装置保证气液充分混合具有足够的冷却面积死角少，灭菌彻底适宜的径高比（高与直径的比值为2.5—4）发酵罐的类型•搅拌釜反应器•鼓泡式反应器•气升式反应器发酵辅助设备无菌空气系统•无菌空气的要求灭菌系统、管道、阀门培养基及其灭菌培养基（medium）培养基的成分•碳源、氮源、无机盐、前体物、促进剂、抑制剂培养基的类型•按组成•按状态•按用途培养基灭菌•空罐灭菌•实罐灭菌•连续灭菌：高温短时L/O/G/O第四节发酵工程制药的过程与控制种子的扩大培养微生物发酵方式•分批发酵•补料分批发酵•半连续发酵•连续发酵发酵过程中的中间分析项目产物产量pH糖氨基氮菌丝形态发酵过程的影响因素及控制菌体浓度营养物质温度pH溶氧泡沫染菌发酵终点的判断菌体浓度•在适合的生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比关系。特别是初级代谢产物。•菌体浓度过低，产物产率下降。•菌体浓度过高，产生其他影响。•措施：调节培养基中的营养物质的浓度。营养物质•碳源•氮源•磷酸盐：生长亚适量浓度•补料：半饥饿状态温度•考虑菌种及生长阶段•综合考虑其他培养条件•考虑菌种生长情况•发酵热pH•补加酸或碱和补料的方式溶氧和CO2•溶氧异常下降•溶氧异常上升措施泡沫•负面影响•措施染菌•发酵前期染菌•发酵后期染菌发酵终点的判断•提高产物的产量和经济效益•降低生产成本主要指标与中间分析项目雷同L/O/G/O第五节发酵工业中的代谢调控代谢调控•运用人为的方法对微生物的代谢调节系统进行遗传改造和条件的控制，在保证微生物适当生长的条件下，建立新的代谢方式，以期按照人们的意志有目的地过量积累所需的代谢产物，提高生产效率。初级代谢•能使营养物质转变成机体的结构物质和对机体具有生理活性作用的物质，或是为机体生长提供能量的一类代谢。次级代谢•存在于某些生物中（如某些植物和微生物），并在一定的生长期内出现的一类代谢。在抵御恶劣环境、伪装躲避、清除自身毒素和排泄物时很重要。微生物初级代谢与次级代谢的关系多糖、蛋白质、脂肪、无机盐初级代谢中间产物（单糖、氨基酸、核苷酸、脂肪酸）蛋白质、核酸、粘多糖、脂多糖等生物大分子分解合成分解代谢生物合成生长抗生素、生物碱、色素、毒素等次级代谢产物代谢产物合成的调控•初级代谢对次级代谢的调节•碳代谢物的调节•氮代谢物的调节•磷酸盐的调节•ATP的调节•诱导物调节•末端产物的反馈调节•细胞膜通透性调节•其他：金属离子、溶解氧等的调节初级代谢对次级代谢的调节•次级代谢产物以初级代谢产物为母体衍生而来。•次级代谢产物合成反应的酶由初级代谢途径的酶演化而来。•因此，初级代谢终产物的过量往往会抑制次级代谢产物的合成。碳代谢物的调节葡萄糖效应解除方法•变更速效碳源和迟效碳源的配比；•流加葡萄糖。氮代谢物的调节分解代谢物阻遏效应解除方法•变更速效氮源和迟效氮源的配比；•流加无机氮。磷酸盐的调节磷酸盐效应：类似于葡萄糖效应机制：•促进初级代谢、抑制次级代谢•抑制次级代谢产物前体的形成•阻遏某些关键酶的合成•抑制某些关键酶的活性•增加菌体能荷状态的调节•直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。•如四环素的合成。诱导物调节•某些参与次级代谢产物合成的酶为诱导酶。•需有诱导物存在，诱导酶才能形成。•如甲硫氨酸诱导头孢菌素C。末端产物的反馈调节•末端产物抑制合成途径中的第一个酶的活性，从而降低产物合成代谢的能力。•原位产物分离偶联技术（insituproductremoval，ISPR）细胞膜通透性调节•利于代谢产物分泌到胞外，减少胞内浓度，从而避免末端产物的反馈调节。•如：谷氨酸的生产，采取控制生物素浓度、添加青霉素、添加吐温80等表面活性剂、选育油酸缺陷型菌株等方法。L/O/G/O抗生素的发酵生产抗生素的定义•生物在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓度下有选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞的有机物。发展历史•1929年，英国弗莱明发现青霉素。二战期间，大规模发酵生产，世界上最早用于临床的抗生素。•20世纪60-70年代，利用生物合成和半合成方法研制抗生素衍生物。•20世纪80年代至今，根据作用机理理性筛选阶段，包括耐药筛选模型等。抗生素的分类•根据抗生素的生物来源分•根据抗生素的作用对象分•根据抗生素的作用机制分•根据抗生素的化学结构分根据抗生素的生物来源分•放线菌产生的抗生素：链霉素、四环素、红霉素•真菌产生的抗生素：青霉素、头孢菌素•细菌菌产生的抗生素：多粘菌素、杆菌肽根据抗生素的作用对象分•抗G+的抗生素：青霉素、红霉素•抗G-的抗生素：链霉素、多粘菌素•广谱抗生素：氨苄青霉素•抗真菌抗生素：两性霉素•抗病毒和噬菌体抗生素：氯霉素、艾霉素•抗原虫抗生素：灭滴虫素•抗癌抗生素：阿霉素、博莱霉素根据抗生素的作用机制分•抑制细胞壁合成：青霉素、头孢菌素•抑制细胞膜功能：多粘菌素•干扰蛋白质合成：四环素•抑制核酸合成：博莱霉素、利福霉素•抑制生物能作用：抗霉素根据抗生素的化学结构分•β-内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类•氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素•大环内酯类：红霉素、麦迪加霉素•四环类：四环素、土霉素•多肽类：多粘菌素=CH2-CO-β-内酰胺类抗生素的结构特征(CH3)2OHCONH2OHR,R'=HTetracyclineR'=OHOxytetracyclineR=ClChlotetracyclineR'大环内酯类和四环类抗生素的结构特征α-氨基己二酸+L-半胱氨酸+L-缬氨酸ACV三肽ACV合成酶异青霉素N(IPN)异青霉素合成酶6-APA青霉素N，…青霉素G头孢菌素Cβ-内酰胺类抗生素的代谢调控•碳源分解代谢物阻遏•赖氨酸的反馈调节：共同中间体•L-甲硫氨酸对头孢菌素C的诱导作用•头孢菌素C的扩环/羟化双功能酶需Fe2+，分子氧等辅助因子•缬氨酸是青霉素生物合成的前体青霉素的发酵生产•工艺流程工艺控制要点生产种子的制备•丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小（大）米固体培养基上，25℃培养7天，真空干燥并以这种形式保存备用。生产时按10%接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内，26℃培养至菌丝浓度达6-8%，菌丝形态正常，按10-15%的接种量移入含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内，27℃培养至菌丝浓度10-12%，形态正常，即可作为发酵种子。培养基成分的控制碳源•产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前生产上普遍采用的是淀粉水解液、糖化液为碳源，进行连续流加的方式。氮源•氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。前体•生物合成含有苄基基团的青霉素G，需在发酵液中加入前体。前体可用苯乙酸、苯乙酰胺，一次加入量不大于0.1%，并采用多次加入，以防止前体对青霉素的毒害。无机盐•加入的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等,且用量要适度。另外，由于铁离子对青霉菌有毒害作用,必须严格控制铁离子的浓度，一般控制在30μg/ml。发酵培养的控制加糖控制•加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的pH值确定。最好是根据排气中CO2量及O2量来控制，一般在残糖降至0.6%左右，pH值上升时开始加糖。•加糖率：0.07-0.15%，每2h一次或连续流加。补氮及加前体•补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素。发酵60-70开始补加，使发酵液氨基氮控制在0.01%-0.05%。•发酵8-12h后补前体，以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为0.05%-0.08%。值控制•一般为pH6.5-6.9，尽量避免超过pH7.0。•pH上升可以补加葡萄糖或天然油脂来控制；•pH下降则提高通气量，或补加氨水和碳酸钙来控制。•目前生产上趋于采用直接加酸或加碱自动控制pH。温度控制•前期25-26℃，后期23℃，以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。溶解氧和搅拌速率的控制•一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30%。通风比一般为1:0.8vvm。•搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。泡沫的控制•在发酵过程中产生大量泡沫，可以用天然油脂，如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂“泡敌”来消泡，应当控制其用量并要少量多次加入，尤其在发酵前期不宜多用，否则会影响菌体的呼吸代谢。发酵液质量控制•生产上按规定时间从发酵罐中取样，用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称“镜检”，根据“镜检”中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度，通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间，以获得最多青霉素。发酵液的过滤和预处理•低温•过滤：鼓式过滤或板框过滤•杂蛋白去除：硫酸调pH4.5-5.0，0.07%絮凝剂PPB和0.07%硅藻土二次过滤。萃取•乙酸丁酯（BA）二次萃取法•一次萃取：pH1.8-2.2，浓缩倍数1.5-2.0。•反萃取：pH6.8-7.2，浓缩倍数3-4。•二次萃取：pH1.8-2.2，浓缩倍数2-2.5。•萃取方式：多级逆流萃取结晶•结晶方法：碱金属盐法和普罗卡因盐法•碱金属盐法：二次BA萃取液中加入乙酸钾或乙酸钠的乙醇溶液，青霉素钾盐或钠盐结晶析出。•重结晶方法：真空共沸蒸馏结晶法•普罗卡因盐法：在青霉素钾盐的水溶液中（pH中性）加入盐酸普罗卡因溶液，普罗卡因青霉素结晶析出。其他微生物药物的发酵生产•头孢菌素C•氨基酸：谷氨酸、赖氨酸•维生素：B1、B2、B