实验室仪器设备、器皿及用具

第二章实验室仪器设备、器皿及用具白凤麟2013.9.12一、实验室设置二、实验室仪器三、实验室器皿及用具四、洗涤技术五、灭菌技术六、无菌操作技术组织培养实验室布局的总体要求便于隔离便于操作便于灭菌便于观察一、实验室设置基本布局规律根据实验操作程序排列实验室；接种室和培养室设在与外界环境隔离性好的区域；灭菌室与接种室相邻；其他实验室的布局可根据条件，以方便使用为宜。基本实验室辅助实验室实验室组成准备室缓冲室无菌操作室培养室细胞生物学实验室温室生化分析实验室基本实验室布局平面图实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室缓冲室无菌室培养室植物组织培养实验室布局示意图培养室准备室灭菌室储藏室接种室缓冲室组织培养准备实验室1.准备室1.1洗涤间根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。地面应耐湿并排水良好。超声波清洗器面积60平方米左右，配备的主要仪器设备有：冰箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积180-200L为宜，用于储存培养基母液、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保存植物材料。天平应有不同感量。1.2培养基配制间1.准备室配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。如果没有条件的话，可以将上述工作间合并成一个准备间，要求是设备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。1.3消毒间1.准备室2.缓冲室无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种接种器械等。3.无菌操作室无菌室无菌室为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养。培养室外应有一预备间或走廊。培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用40W，固定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在20cm，光照强度为2000-3000lx。4.培养室设计组培实验室时的注意事项•为了减少污染，实验室最好设一走廊且走廊上方最好安装紫外灯；•培养室最好设在南面，设大玻璃窗，以双层玻璃窗为最好。如果培养室是设在房屋的边侧，其东边或西边的墙上也可设置大玻璃窗；•培养室房间及门要小，而且密闭性要好，最好装移门；•无菌操作室要小，要设缓冲间，也最好装移门，且门要稍大一些。二、仪器与设备1、基本设备冰箱、电炉、酸度计、纯水器、天平、培养基分装器、搅拌器等。酸度计电热套天平培养基分装器搅拌器2、灭菌设备蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。蒸汽压力灭菌锅干热消毒柜利用高温干热对微生物有氧化、蛋白质变性、电介质浓缩引起中毒等作用。其中主要是通过氧化作用破坏细胞原生质，使微生物死亡，所以在一定的加热时间内可杀死一切微生物。无菌瓶顶过滤装置喷雾消毒器（参考图）（参考图）接种器具消毒器3、无菌操作设备超净工作台无菌接种箱4、细胞培养设备摇床培养架恒温振荡培养箱光照培养箱5、细胞学鉴定设备光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜倒置显微镜光学显微镜1、玻璃器皿三、培养器皿及实验用具培养皿三角瓶培养瓶2、金属材质用具镊子解剖刀接种针1、玻璃器皿洗涤新购置玻璃器皿1%稀HCl浸渍12h洗衣粉洗涤清水冲洗晾干备用已用过的玻璃器皿四、洗涤技术清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。2、塑料用品洗涤新的塑料器皿打开即用已用过的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水冲洗2%—5%盐酸浸泡30min清水冲洗蒸馏水冲洗晾干备用金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。3、金属用品洗涤（一）、灭菌工作是极其重要的。首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴：有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）物理或化学处理；火烤后的物体；健康的动植物不与内外部表面接触的组织内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）五.灭菌技术1、物理方法：干热、湿热、过滤（0.25微米）紫外灯、超声波等。2、化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等。五.灭菌技术干热灭菌玻璃器皿、器械湿热灭菌培养基、蒸馏水、器械、棉塞等熏蒸灭菌接种室、培养室过滤灭菌液体培养基、蒸馏水药剂灭菌培养材料烧灼灭菌器械、瓶口、棉塞、包头纸辐射灭菌接种室、培养间（一）各种灭菌方法及其使用范围适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：150℃、40min或120℃、120min，如果发现芽孢杆菌，160℃、90～120min（1）干热灭菌适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121℃维持20～30min注意点：加足水、排尽气、气压降到0时，才能开盖。（2）湿热灭菌培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌。灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.22～0.45微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50℃左右时，加入适量的激素，然后分装。（3）过滤灭菌主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间20～30min。注意：关灯后5min后再进入。超净工作台关灯后要打开风机。（4）射线灭菌用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。（5）火焰灼烧灭菌适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。几种常用消毒剂的效果比较消毒剂使用浓度(%)消毒时间(min.)效果残液去除难易乙醇70-750.1-3好易新洁尔灭10～205～30好易氯化汞0.1～12～15最好最难过氧化氢10～125～15较好最易抗菌素4～50mgl-130～60较好较难次氯酸钙/纳9～105～30好易（6）消毒剂长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。（7）熏蒸灭菌甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2小时进行。对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸。（二）接种室灭菌空气消毒灭菌接种室超净工作台紫外灯照射70%—75%的酒精擦洗培养材料的接种紫外灯照射（三）外植体灭菌流水冲洗10—20min或更长时间70%—75%酒精中浸泡30s0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸馏水冲洗4—5次在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右备用常用消毒剂消毒灭菌比较表消毒剂使用浓度（%）去除难易消毒时间（min）效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗生素硝酸银9~102饱和溶液1~210~120.1~170~754~5（mg/L1易易易易最易较难易中较难5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好较好好污染来源人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培养皿：洗→热压玻璃器皿：洗→干热（干热箱）或晾干接种用具：用CCL4布擦→湿布擦→泡75%~95%酒精→烧培养基：湿热培养材料外部细菌：用水冲洗→化学药剂处理内部细菌茎尖培养加抗生素：青霉素、利福平操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台用化学试剂薰蒸六、无菌操作技术1、实验器具和材料的准备2、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。3、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）六、无菌操作技术4、用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。5、取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。6、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。注意（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。（2）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。（3）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。（5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。（6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。（7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中。正确错误整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速。正确错误接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染正确错误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正确错误瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正确错误接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生配方成分弱液次强液强液常用配方重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）501001000100200100060800200100200800清洁液配方实验员消毒实验室、无菌台灭菌实验器材的灭菌无菌接种消毒实验台卫生培养室培养