第二章生理学实验常用仪器和设备

第二章生理学实验常用仪器和设备1--1第二章生理学实验常用仪器和设备随着科学技术的发展，先进的科学仪器设备在生理学研究中广泛得到应用，才使我们对生命活动有了更为本质的认识。因此学习和掌握和生理学常用仪器、设备的使用方法对做好生理学实验是十分重要的。生理学实验仪器一般分五大部分组成，即刺激系统、引导换能系统，信号调节放大系统、显示记录系统和机体（或离体组织）生命维持设备（图2-1）。图2-1生理学实验仪器组成示意图刺激系统是欲对研究的对象施加刺激，引起其生理功能变化（即产生兴奋）的一套仪器。生理实验中应用昀多的是电刺激，电刺激系统包括电子刺激器、刺激隔离器和各种电极。当生理信号是电信号时，引导系统可能是引导电极，包括记录单细胞电活动的玻璃微电极以及记录群细胞电活动的金属电极；当生理现象为其它某种能量形式时，如机械收缩、压力、振动、温度和某种化学成分变化等，需要将原始生理信号转换为电信号，加以引导，这就是换能器。由于生物信号较为微弱，信号调节放大系统则是一种放大器或放大器的组合，对信号基线的位置和输出信号幅度的高低（增益）进行调节。经典实验中各式各样的杠杆和传动装置也起着信号调节作用，现代仪器设备包括示波器、记录仪中的放大器部分和专用的前置放大器、微电极放大器。显示记录系统通常使用记纹鼓、示波器或记录仪。记纹鼓是一种较为原始的经典记录仪。由于计算机技术的发展，计算机生物信号采集处理系统在生理学实验中已广泛应用，有代替刺激器、放大器、示波器和记录仪的趋势。机体或离体组织生命维持系统如：动物人工呼吸机、恒温槽，肠肌、血管、气管和子宫等离体灌流装置，Langendorff心脏离体灌流装置和神经屏蔽盒等。信号调节系统刺激系统引导换能系统显示、记录系统（计算机生物信号采集处理系统）生命维持系统测量、统计实验对象第二章生理学实验常用仪器和设备2--22.1刺激系统为了引起组织或细胞产生兴奋，通常采用刺激的方法。在各种刺激中，电刺激不易损伤组织，能定时、定量并可重复使用。因此，它是生理学实验中经常使用的刺激方法2.1.1电刺激电刺激是流入可兴奋组织的一个或多个电流脉冲所组成。进行电刺激时首先遇到的问题是所用的电刺激的各种参数问题。采用不同的参数刺激同一组织结构，可出现不同的、甚至相反的反应。电刺激时以下各重要的参数需要加以考虑：（1）刺激电流的波形大致有三种，即正弦波（sinewave）、方波（squarewave）和不对称的波形（如感应电波）。其中用的昀多的是方波，电流的上升时间是几微秒到几十微秒，持续时间从几十微秒到几秒。常用方波刺激的原因，不仅是由于波形简单，易于产生和严格控制，而且计算刺激量也比较容易，陡峭的前沿刺激电流也比较有效。但是采用单向方波刺激时若波宽太大(超过1ms)，或采用直流电刺激作用时间太长，均可引起很大的损毁效应。为了尽量减少刺激电流引起的热和电解作用对生物体的影响，在保持刺激有效的前提下，必须尽可能地缩短刺激时间，并采用双向方波刺激，后者特点在于：在正方波时离子向一个方向运动，紧接着来的负方波使离子向相反方向运动，这样可极大地减少电解作用。（2）刺激强度可用电压（电位差）或电流的强度来表示。电流强度一般在几μA到几十mA，电压可在200V以内，在某些特殊情况下可超出这个范围。电刺激之所以能引起组织兴奋，是由于它可使细胞静息电位降低到阈电位，若用的电流太低则不能引起兴奋，电流过大，则对引起兴奋来说，不再起什么更大的作用，反而可引起组织内电解和发热效应，使细胞受到破坏。因而进行电刺激时，要控制电压强度或刺激电流密度。一般电流与电压强度是平行增减的。但实验证实，经多次刺激后，电压的变化不大，而电流则随电极尖部的极化作用而降低。（3）刺激频率一般不大于1000次/s。当刺激频率过高时，有一部分刺激会落在组织的不应期而无效，使刺激与生理效应不能同步。刺激频率的选择随被刺激组织的不同而变化。在生理学实验中，应用连续刺激时，还可根据实验需要调节“串长”。当一串刺激停止后，在一些脑组织结构中的后效应可延续几毫秒到几秒之久。经较长时间连续刺激后，被刺激的部位可能出现增益作用，有时亦可引起效应减弱（疲劳）。对于引起机体活动的中枢神经结构，每串刺激时间可用10～20秒。超过这一限度常可致“疲劳”。为了避免一串刺激对下一次刺激的影响，在安排刺激程序时，各串刺激彼此相隔的时间，必须加以考第二章生理学实验常用仪器和设备3--3虑。2.1.2电刺激器电刺激器用来产生参数精确稳定的刺激电流。随着计算机技术在机能学实验中的广泛应用，传统的电子管和晶体管刺激器已被数字化程控刺激器所代替。数字化程控刺激器与生物信息采集、处理等集成在一块多功能卡上，插接在主板的功能扩展槽内，通过应用软年选择刺激的有关参数。刺激参数包括（图2.1-1）：图2.1-1电子刺激器的方波刺激和各参数示意图（1）强度（V或mA）以矩形方波的波幅（方波的高度）表示，表示刺激输出的电压或电流大小。（2）波宽（ms）表示输出的每个刺激方波持续的时间。（3）频率（Hz）表示连续脉冲或串脉冲的频率。其计算方法为：F＝1／T其中F为频率（单位：Hz）；T为周期，即波宽与波间隔之和，单位是秒（s）。（4）波间隔（ms）双、串、连续脉冲中两脉冲波之间的时间间隔。（5）串长表示以重复频率的不断地输出数个（一连串）刺激脉冲持续时间。（6）延迟（ms）表示启动刺激到刺激输出的延迟时间；调节延迟，可使刺激脉冲或由刺激脉冲引起的生理反应能在荧光屏上的适当位置展现，以便观察和记录。（7）串间隔在连续的串刺激中，一串刺激脉冲连续出现时的时间间隔。选择刺激参数时，要注意频率（或主周期）与延迟、波宽、串（脉冲）个数和波间隔的关系。应保证：主周期＞延迟＋波宽，或主周期＞延迟＋波间隔×串个数。例如，当选择连续刺激时，主周期为100ms，波宽为80ms，延迟为50ms时，则刺激器不能按上述要求输出刺激，因为此时，周期＜延迟＋波宽。第二章生理学实验常用仪器和设备4--4在计算机生物信号采集处理系统中，上述参数可出现在：①模式，包括正电压刺激、负电压刺激、正电流刺激及负电流刺激；②方式；③延时；④波宽；⑤波间隔；⑥频率；⑦强度1及强度2（双刺激时）；⑧主周期；⑨程控增量，表示程控刺激参数的增量或减量。在实际中常根据生理学需要，把刺激器、记时、记滴器组装在一起成为综合性的生理实验多用仪，如图2.1-2。图2.1-2JJC-2型生理实验多用仪2.1.3刺激伪迹和刺激隔离器生物体的各种体液的导电性是相当好的。这使生物体成为一个容积导体。当对实验动物同时进行刺激和记录生物电时，刺激器输出和放大器输入具有公共接地线，使得一个部分刺激电流流入放大器的输入端，使记录设备记录到一个刺激电流产生的波形，这不是要记录的生物电，因此叫做刺激伪迹（stimulusartifact）。因为生物电是很微弱的，当刺激电极靠近记录电极时，刺激伪迹往往是远远超过生物电。有时刺激伪迹能使记录系统进入不正常甚至完全阻塞的状态。伪迹过后还有一段时间不能恢复正常，严重地干扰了生物电的记录。如何减少伪迹？首先要在电生理实验设计中，在实验条件许可的情况下尽量使刺激电极和记录电极离得远些，这是减少伪迹的根本的方法。但是常常由于实验的要求，刺激电极和记录电极必须靠得很近，这是为了减少刺激伪迹还得采取以下几种方法：（1）应用刺激隔离器（stimulusisolator）它是刺激器一个重要附件，使刺激电流两个输出端与地隔离，切断了刺激电流从公共地线返回的可能，使刺激电流更局限在刺激电极的周围，伪迹即可减小。（2）在生物体上适当接地，甚至有时多点接地，通过移动接地点的位置使刺激电流第二章生理学实验常用仪器和设备5--5在容积导体中的分布变化，使记录放大器的两个输入端恰好在等位面上，刺激伪迹抵消为零。（3）旋转刺激电极或记录电极的方向在实验许可的前提下，有时旋转刺激电极，有时旋转记录电极，有时同时旋转二者，其目的是使两个电极处在刺激电波电场的等位线。2.1.4电极（electrode）刺激器输出的电脉冲必须通过电极才能作用组织或细胞。电极依其使用目的不同，可分为普通电极、保护电极、乏极化电极、微电极等多种（图2.1-3）。图2.1-3刺激电极A．普通电极；B．保护电极；C．乏极化电极（1）普通电极通常是在一绝缘管的前端安装两根电阻很小的金属比（常用银丝或不锈钢丝、钨丝)，其露出绝缘管部分仅5mm左右，金属丝各连有一条导线，可与刺激器的输出端(作刺激电极用时)或放大器输出入端(作引导、记录电极用时)相接。使用此电极时，应注意电极一要碰到周围的组织（图2.1-3）。（2）保护电极其结构与普通电极相似，特点是前端的银丝嵌在绝缘保护套中，使用此种电极刺激在体神经干时，可保护周围组织不受刺激（图2.1-3）。（3）锌铜弓（锌铜夹，Galvani镊子）锌铜弓实际上是一个带有简单锌铜化学电池的双极刺激电极（图2.1-4），常用来检查坐骨神经腓肠肌标本的机能状况。其结构是平行排列的一根粗锌丝(片)和一根粗铜丝(片)，二者的顶端焊接在一起。当锌铜弓与湿润的活体组织接触时，由于锌较铜活泼，易失去电子形成正极，使细胞膜超极化，铜得到电子成为负极，使细胞膜去极化而兴奋。电流按锌→活体组织→铜→的方向流动。用锌铜弓检查第二章生理学实验常用仪器和设备6--6活体标本时，组织表面必须湿润。图2.1-4锌铜弓及其电极电位的产生（4）乏极化电极（non-polarizableelectrode）当用直流电刺激组织或记录直流电位(如细胞膜静息电位)时，由于细胞内、外液均为电解质溶液，当两电极间的回路中有直流电通过时，阳极周围将有负离子堆积，阴极周围将有正离子堆积，时间越长，两极下的堆积的相反离子越多，此即极化现象。这些堆积的极相相反的离子会产生反向电流，使通电电流逐渐减小，断电时又可形成反向刺激电流。此外电解所产生物质附于电极上，可使电极电阻变大，电流变小，同时影响到组织的兴奋性。此时必须使用乏极化电极。目前多用银-氯化银的乏极化电极。该电极有时也用于记录电极。Ag-AgCl电极当接通直流电时，在正极组织液中的Cl－与Ag＋结合生成AgCl，而Ag原子与Cl－结合生成AgCl并释放出1个电子，电子经导线移向负极，不会出现Cl－的聚集。在负极，Na＋与Cl－结合生成NaCl，而Ag＋与1个电子结合成Ag原子，也不会出现Na＋的聚集。Ag-AgCl电极可在实验室用电镀法制备。制作时先用细砂纸打磨电极表面，然后用脱脂棉醮金刚砂粉沿单方向摩擦电极表面，昀后用酒精、乙醚、蒸馏水彻底清洗。电极的表面不得有凹陷或电流难以到达之处。电镀时应将欲电镀的电极并联在一起作为阳极，另用一面积更大的高纯度银板（或铂、石墨）作为阴极，二者均插入0.1mol/L盐酸电镀液中，并分别接至可调直恒流电流的正、负端。电流密度和氯化银沉积量，可分别按0.1mA/cm2或100～500mA·s/cm2计算和控制。（5）微电极（microelectrode）在进行细胞水平电活动的实验时，必须使用微电极。微电极可分为金属微电极和玻璃微电极两大类。①金属微电极常用银丝、白金丝、不锈钢丝、碳化钨丝在酸性溶液中电解腐蚀而成，尖端以外部分用漆或玻璃绝缘。有双极或单极引导电极，多用于细胞外记录和皮层诱发电第二章生理学实验常用仪器和设备7--7位等。②玻璃微电极用单、双、多管，用硬质的毛细玻璃管拉制而成（图2.1-5）。用于细胞内记录时，其尖端需小于0.5μm；用于细胞外记录时，其尖端可为1～5μm.。微电极内常充灌3mol/LKCl溶液，从电极的粗端插入银-氯化银电极丝。图2.1-5玻璃微电极结构A．单管玻璃微电极；A．多管玻璃微电极目前多用微电极拉制仪制备玻璃微电极。其原理是将一玻璃毛胚管穿过一加热线圈的中央，将其两端固定。当电流通过线圈时线圈发热，玻璃毛胚受热融化，在附加重力或（电）磁力的吸引牵拉下将熔化部位的玻璃毛胚拉细、拉长。当拉力超过玻璃的内聚力时，毛胚断裂。如果加热电流和拉力配合适中，就可拉出尖端外径小于1μm的锥形微玻璃管，将导电的溶液（