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灭菌设备的验证徐志敏目录1、灭菌的概念2、灭菌的方法3、灭菌的验证4、生物指示剂5、消毒与灭菌一灭菌的概念•灭菌是用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去的方法。•无菌物品是指物品中不含任何活的微生物。对任一批产品来说，绝对的无菌既无法保证也无法用实验来证实。实际生成过程中，灭菌是指将物品中污染的微生物残存概率下降至一定水平，以无菌保证水平SAL表示。最终灭菌的产品微生物存活概率不得高于10-6。二灭菌的方法常用的灭菌方法有：•湿热灭菌法•干热灭菌法•辐射灭菌法•气体灭菌法和过滤除菌法。只要产品允许尽量采取最终灭菌的方法。1、湿热灭菌•是用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。•灭菌能力强，是热力灭菌中最有效，应用最广泛的灭菌方法。•适用范围：遇高温和潮湿不发生变化和损坏的物品。如容器、培养基、胶塞、无菌衣等。•热压灭菌用的灭菌器种类很多，但其基本结构大同小异。•注意：被灭菌物应有适当的装载方式，不能排列过密。以保证灭菌的有效性及均一性。•必须将灭菌器内的空气排出。如果灭菌器内的空气存在，则压力表上所表示的压力是器内蒸气和空气二者的总压而非单纯的蒸气压力。1、湿热灭菌2干热灭菌法•系指物品于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中、利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。•适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌的物品的灭菌，如玻璃器具、金属制容器、纤维制品、固体试药、液状石蜡等均可采用本法灭菌。•干热灭菌条件：一般为160～170℃×120min以上、170～180℃×60min以上或250℃×45min以上，也可采用其它温度和时间参数。总之，应保证灭菌后的产品其SAL（无菌保证水平）≤10-6•注意：被灭菌物品应有适当的包装和装载方式，保证灭菌的有效性和均一性2干热灭菌法•干热灭菌法验证与湿热灭菌法相同，应进行热分布试验、热穿透试验、生物指示剂验证试验或细菌内毒素灭活验证试验。以确认灭菌柜中的温度分布符合设定的标准、确定最冷点位置等。常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子。细菌内毒素灭活验证试验是证明除热原过程有效性的试验。一般将不小于1000单位的细菌内毒素加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内毒素至少下降3个对数单位。细菌内毒素灭活验证试验所用的细菌内毒素一般为大肠埃希菌内毒素。验证时，一般采用最大装载方式。2干热灭菌法•系指将灭菌产品置于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。•本法最常用的为60Co-γ射线辐射灭菌。医疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品等均可用本法灭菌。3辐射灭菌法•辐射灭菌所控的参数主要是辐射剂量（指灭菌物品的吸收剂量）。该剂量的制定应考虑灭菌物品的适应性及可能污染的微生物最大数量及最强抗辐射力，所使用的剂量事先应验证其有效性及安全性。常用的辐射灭菌吸收剂量为25kGy.对最终产品、原料药、某些医疗器材应尽可能采用低辐射剂量灭菌。•灭菌时，应采用适当的化学或物理方法对灭菌物品吸收的辐射剂量进行监控，以充分证实灭菌物品吸收的剂量是在规定的限度内。3辐射灭菌法•系指用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法。•常用的化学消毒剂有环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛、臭氧（O3）等，本法适用于在气体中稳定的物品灭菌。采用气体灭菌法时，应注意灭菌气体的可燃可爆性、致畸性和残留毒性。•本法中最常用的气体是环氧乙烷，一般与80％～90％的惰性气体混合使用。该法可用于医疗器械，塑料制品等不能采用高温灭菌的物品灭菌。含氯的物品及能吸附环氧乙烷的物品则不宜使用。另外，使用气态过氧化氢和臭氧（O3）灭菌，因其无危害性残留物，不会对操作人员和环境造成危害，适合于空间和物品表面的灭菌。4气体灭菌法•臭氧灭菌：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧气和单个氧原子；后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，将其杀死，多余的氧原子则会自行重新结合成为普通氧原子，不存在任何有毒残留物，故称无污染消毒剂，它不但对各种细菌（包括肝炎病毒，大肠杆菌，绿浓杆菌及杂菌等）有极强的杀灭能力，而且对杀死霉素也很有效。4气体灭菌法•1、臭氧的灭菌机制及过程类属于生物化学过程，氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的葡萄糖氧化酶。•2、直接与细菌、病毒发生作用，破坏其细胞器和核糖核酸，分解DNA、RNA，蛋白质、脂质类和多糖等大分子聚合物，使细菌的物质代谢生产和繁殖过程到破坏。•3、渗透胞膜组织，侵入细胞膜内作用于外膜脂蛋白和内部的脂多糖，使细胞发生通透畸变，导致细胞溶解死亡。4气体灭菌法•系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。•适用于热不稳定的药品溶液或原料的除菌。•除菌过滤器微孔滤膜分亲水性和疏水性两种。对除菌过滤器的要求：除菌过滤器必须选择具有截留实验证明的除菌级过滤器。药品生产中采用的除菌滤膜孔径一般不超过0.22μm.过滤器不得对被滤过成分有吸附作用，也不能释放物质，不得有纤维脱落，禁用含石棉的过滤器。滤器和滤膜在使用前应进行洁净处理，并用高压蒸汽进行灭菌或作在线灭菌。更换品种和批次应先清洗滤器，再更换滤膜。5除菌过滤法•过滤过程中无菌保证与过滤液体的初始生物负荷及过滤器的对数下降值LRV（LogReductionValue）有关。LRV系指规定条件下，被过滤液体过滤前的微生物数量与过滤后的微生物数量比的常用对数值。•即：LRV=lgN0-LgN•式中N0为产品除菌前的微生物数量。•N为产品除菌后的微生物数量。5除菌过滤法•在过滤除菌中，一般无法对全过程中过滤器的关键参数（滤膜孔径的大小及分布，滤膜的完整性及LRV）进行监控。因此，在每一次过滤除菌前后均应作滤器的完整性试验，即气泡点试验或压力维持试验或气体扩散流量试验。确认滤膜在除菌过滤过程中的有效性和完整性。除菌过滤器的使用时间不应超过一个工作日，否则应进行验证。5除菌过滤法•SAL：（SterilityAssuranceLevel）无菌保证水平，一批物品的无菌特性一般以物品灭菌后微生物存活的概率来表示。•最终灭菌产品微生物存活的概率不得高于10-6已灭菌产品达到的无菌保证水平可通过验证确定。•F0值：为标准灭菌时间，系灭菌过程赋予被灭菌物品121℃下的灭菌时间。•D值：微生物的耐热参数，系指一定温度下，将微生物杀灭90%所需的时间，以分钟表示。1、灭菌程序的验证•灭菌程序的验证是无菌保证的必要条件。灭菌程序经验证后，方可交付正式使用。验证内容包括：•⑴撰写验证方案及制定评估标准。•⑵确认灭菌设备技术资料齐全、安装正确，并能处于正常运行（安装确认）。•⑶确认关键控制设备和仪表能在规定的参数范围内正常运行（运行确认）。•⑷采用灭菌物品或模拟物品进行重复试验，确认灭菌效果符合规定（性能确认）。•⑸汇总并完善各种文件和记录，撰写验证报告。二灭菌的验证2灭菌效果的验证•（1）湿热灭菌效果验证：应进行热分布试验、热穿透试验和生物指示剂验证试验。以确定灭菌柜空载及不同装载时腔室中的热分布状况及可能存在的冷点；在空载条件下，确认121℃时腔室的各点的温度差值应≤±1℃；使用插入实际物品或模拟物品内的温度探头，确认灭菌柜在不同装载时，最冷点物品的标准灭菌时间（F0）达到设定的标准；用生物指示剂进一步确认在不同装载时冷点处的灭菌物品达到无菌保证水平。本法常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子。••具体方法:将生物指示剂和被灭菌物品仪一起放入灭菌容器内，二层设3个点，上层中央1点，下层前后部位各1点；三层设3个点，上层与中央部位各1个点，下层前中后各1个点。•灭菌后取出，56~60℃培养24~48h，并取另一支未经灭菌的生物指示剂一起培养，作为阳性对照。•结果判断：颜色的变化。•培养后保持紫色Pass培养后紫色→黄色Fail阳性对照培养后紫色→黄色Pass2灭菌效果的验证•（2）干热灭菌法验证：应进行热分布试验、热穿透试验、生物指示剂验证试验或细菌内毒素灭活验证试验。以确认灭菌柜中的温度分布符合设定的标准、常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子。细菌内毒素灭活验证试验是证明除热原过程有效性的试验。一般将不小于1000单位的细菌内毒素加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内毒素至少下降3个对数单位。细菌内毒素灭活验证试验所用的细菌内毒素一般为大肠杆菌内毒素。验证时，一般采用最大装载方式。2灭菌效果的验证•（3）气体灭菌法验证：•采用环氧乙烷灭菌时，灭菌柜内的温度、湿度、灭菌气体浓度、灭菌时间是影响灭菌效果的重要因数。可采用下列灭菌条件：•温度（54±10）℃相对湿度（60±10）%•灭菌压力8×105Pa灭菌时间90min2灭菌效果的验证•灭菌条件应予验证方法：灭菌时，先将灭菌腔室先抽成真空，然后通入蒸汽使腔室内达到设定的温湿度平衡的额定值，再通入经过滤和预热的环氧乙烷气体。灭菌过程中，应严密监控腔室的温度、湿度、压力、环氧乙烷浓度及灭菌时间。必要时使用生物指示剂监控灭菌效果。本法灭菌程序的控制具有一定难度，整个灭菌过程应在技术熟练人员的监督下进行。灭菌后，应采取新鲜空气置换，使残留环氧乙烷和其他易挥发性残渣消散。并对环氧乙烷残留物和反应产物进行监控，以证明其不超过规定浓度，避免产生毒性。•环氧乙烷灭菌法验证时，应进行如下试验：泄漏试验，以确认灭菌腔室的密闭性。•（4）辐射灭菌法验证：•采用辐射灭菌法灭菌的无菌产品其SAL应≤10-6.γ射线辐射灭菌所控的参数主要是辐射剂量（指灭菌物品的吸收剂量）。该剂量的制定应考虑灭菌物品的适应性及可能污染的微生物最大数量及最强抗辐射力，所使用的剂量事先应验证其有效性及安全性。常用的辐射灭菌吸收剂量为25kGy。对最终产品、原料药、某些医疗器材应尽可能采用低辐射剂量灭菌。灭菌前，应对被灭菌物品微生物污染的数量和抗辐射强度进行测定，以评价灭菌过程赋予该灭菌物品的无菌保证水平。2灭菌效果的验证•灭菌时，应采用适当的化学或物理方法对灭菌物品吸收的辐射剂量进行监控，以充分证实灭菌物品吸收的剂量是在规定的限度内。如采用与灭菌物品一起被辐射的放射性剂量计，剂量计要置于规定的部位。•60Co-γ射线辐射灭菌法验证时，除进行生物指示剂验证试验外，还应确认空载和装载时灭菌腔内的辐射剂量的分布图、灭菌物品的吸收剂量及最大和最小吸收剂量的分布、灭菌物品的均一性、灭菌腔内物品的装载方式等。常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子。2灭菌效果的验证三、生物指示剂•生物指示剂是一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设备的性能，灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。•可用于灭菌验证中的生物指示剂一般是细菌的孢子。•1、生物指示剂用微生物的基本要求：•（1）菌种的耐受性应大于需要灭菌物品•中所有可能污染菌的耐受性。•（2）菌种应无致病性。•（3）菌株应稳定。存活期长，易于保存。•（4）易于培养。若使用休眠孢子，生物•指示剂中休眠孢子含量要＞90%。•2、常用的生物指示剂••（1）湿热灭菌法：嗜热脂肪芽孢杆菌孢子•（2）干热灭菌法：枯草芽孢杆菌孢子•（3）辐射灭菌法：短小芽孢杆菌孢子•（4）气体灭菌法：枯草芽孢杆菌孢子•（5）过滤除菌法：缺陷假单孢菌•灭菌条件应予验证。灭菌时，先将灭菌腔室先抽成真空，然后通入蒸汽使腔室内达到设定的温湿度平衡的额定值，再通入经过滤和预热的环氧乙烷气体。灭菌过程中，应严密监控腔室的温度、湿度、压力、环氧乙烷浓度及灭菌时间。必要时使用生物指示剂监控灭菌效果。本法灭菌程序的控制具有一定难度，整个灭菌过程应在技术熟练人员的监督下进行。灭菌后，应采取新鲜空气置换，使残留环氧乙烷和其他易挥发性残渣消散。并对环氧乙烷残留物和反应产物进行监控，以证明其不超过规定浓度，避免产生毒性。具体验证方法1湿热灭菌•常用的生物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌孢子。将生物指示剂和被灭菌物品仪一起放入灭菌容器内，二层设3个点，上层中央1点，下层前后部位各1点；三层设3个点，上层与中央部位各1个点，下层前中后各1个点。•灭菌后取出，56~60℃培养24