高效液相制备色谱的设备进展及应用

高效液相制备色谱的设备进展及应用2019/10/42019/10/4目录液体制备色谱展望高效液相制备色谱柱设备应用2019/10/41液相色谱是将分离填料填装在色谱柱内，以液体流动相进行洗脱，利用药物不同活性成分与填料相互作用力的差异进行分离。输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统高压输液泵在线脱气装置液体制备色谱2019/10/4分类两种模式，一种是在柱上方加压，另一种是在柱下方减压。在低压制备色谱中使用的是颗粒较大的填料，因此其分辨率是有限的。利用恒流泵抽送流动相，带着样品流经色谱柱，实现对样品的分离。其色谱柱一般是由耐压的强化玻璃制成，填料颗粒大小比低压制备色谱所用填料小，分离效率更高。高压液相色谱低压制备色谱中压制备色谱利用更细的高效填料进行分离的，具有高柱效、高流速、分离时间短的特点。与经典液相色谱相比高效液相色谱有很大不同。2019/10/42019/10/42制备型液相色谱制备型液相色谱1.制备型HPLC与分析型HPLC的区别2.PHPLC的装置输液泵进样系统色谱柱系统检测器馏分收集器数据采集与处理系统柱结构柱尺寸柱型对填装的要求2019/10/4•目的不同•流速不同•进样模式不同•上样量不同•色谱柱不同•理论基础不同•检测池不同1.与分析型HPLC的区别2019/10/42.PHPLC装置•输液泵•进样系统•色谱柱系统•检测器•馏分收集器•数据采集与处理系统色谱柱是核心部件，色谱填料的填装是其操作的关键技术。制备型HPLC由于采用细的填料、高压操作，所以色谱柱多用不锈钢制作。2019/10/4制备HPLC的色谱柱系统在此处主要提出色谱柱系统，因为相对于分析型色谱,制备色谱的核心就是色谱柱。为提供既稳定又高效的色谱柱,并用小尺寸颗粒进行填充,最常用也是最易实现的效果较为理想的是动态轴向压缩柱(DACTM)技术。DAC技术为使用者提供了用任一种填料自己装填色谱柱、方便快速地调整柱长度的可能性。在制备型HPLC中,色谱柱的内径可在100～500mm之间。一般增大色谱柱的直径意味着可以承载更多的样品,从而增加产量。增加色谱柱的长度则意味着可加入的样品量和分辨率的增大,但同时也增加了柱压。研究表明对于难分离物系,可以采用直径较小的色谱填料,以提高分离效率,但在分离度可以满足分离要求的前提下,使用较大直径的色谱填料将更为有利。色谱填料的填装是其操作的关键技术。制备型HPLC由于采用细的填料、高压操作，所以色谱柱多用不锈钢制作。2019/10/4制备HPLC的色谱柱系统柱尺寸：柱短、内径大、呈圆饼状在制备型HPLC分离过程中,在满足分离度要求的前提下,可以采用增加制备柱内径的方法提高制备量。柱型：锥型柱与圆柱型柱锥型柱优于圆柱型柱,锥型柱的样品容量约为圆柱型柱的2倍,柱效比圆柱型柱高36%,色谱流出曲线峰值高于圆柱型柱12%。柱结构：空管柱、轴向压缩柱和径向压缩柱对填装的要求：填料的种类、装填技术2019/10/4柱结构1.空管柱与分析柱相同，常用柱内径为10～100mm，采用匀浆填充技术填装色谱填料。2.轴向压缩柱是采用活塞压缩床层，以使色谱柱内填料均匀、密实，得到更高的柱效。其原理是通过活塞的上下移动来装柱、维持柱压和卸柱，活塞周边配置了特殊设计的密封圈，能容许活塞上下自由移动，同时又能保持高的密封性。在柱内的两端均配有多孔不锈钢滤板和能使样品及洗脱液在柱截面上均匀分布的分散器。液流分散器保证了大量样品尽可能地瞬时分散在柱截面上，进而快速均匀进入柱床，克服了柱中心样品局部过浓的现象，保证了色谱柱的高效。根据在分离制备过程中提供给活塞的压力是否持续，可将轴向压缩柱分为静态和动态两种，静态轴向压缩柱的效果比动态的差，但是设备比动态便宜。采用动态轴向压缩柱工艺装填的色谱柱现已基本上主宰了整个制备型色谱柱市场，国内已有动态轴向压缩柱制备色谱系统产品。2019/10/4聊城万合工业制造有限公司自主研发了高效液相轴向加压（自振）制备层析柱系统，配套高压输液泵和检测器，通过计算机自动控制，成功开发了高效液相层析中药提取装备。图1为高效液相轴向加压（自振）制备色谱柱（HPLC-C200型）系统的示意图。2019/10/4•径向压缩柱使用双管的色谱柱，填料装在管壁可压缩的高聚物柱管内制成柱芯，再将装有填料的柱芯放入不锈钢外套中，利用气体或液体施压于柱芯外壁和不锈钢外套之间，压紧柱芯内的填料，使色谱柱得到径向压缩。该技术目的是消除颗粒间及颗粒与管壁间的空隙。径向色谱柱的结构如图4所示，图中表明进入到径向色谱柱的样品和流动相并非如传统的轴向色谱柱从柱的一端流向另一端，而是沿径向流动，即样品和流动相是从色谱柱的周围流向柱圆心。2019/10/4•径向压缩柱的主要缺点是柱芯长度固定，不如轴向压缩柱可以任意调节。此外直径较大的色谱柱中径向经常出现粒度梯度，造成流动相径向流速分布不均匀。由于径向扩散太慢，不能抵消柱截面积流速差异所产生的浓度梯度，所以径向流速是峰展宽的一个重要来源。径向压缩柱主要是由Waters公司生产，并已有预制柱出售。2019/10/4柱尺寸现代高效制备液相色谱柱具有柱短、内径大、呈圆饼状(pancake)的特征。目前高效制备柱的柱长与常规分析柱相仿，一般为20~50cm远短于传统柱1m甚至1m以上的制备柱，在制备型HPLC分离过程中，在满足分离度要求的前提下，可以采用增加制备柱内径的方注提高制备量。柱型制备高效色谱柱按柱型可分为锥型柱与圆柱型柱两大类。锥型柱优于圆柱型柱，锥型柱的样品容量约为圆柱型柱的2倍，柱效比圆柱型柱高36%，色谱流出曲线峰值高于圆林型林12%。2019/10/4制备色谱中对填料的要求一般来说，分析型色谱柱填料也可以用于制备型色谱柱中，但是制备色谱中使用的量大，而且需要反复装柱，因此对于制备色谱填料有一些特殊的要求：（1）机械强度高；（2）负载量高，单位重量的填料负载量高可以处理更多的样品；（3）可大量供应，批间的重现性好；（4）粒径大小合适，布范围窄，在制备分离过程中，对于难分离物系，可以采用较小粒径的色谱填料，以提高分离效率。但在满足分离要求的前提下，使用较大粒径的色谱填料，可以获得较大的生产能力；（5）化学稳定性好，选择性好，无毒，易于填充，价格合理等；（6）通常制备型HPLC每米的塔板数在20000以上，所用填料粒径一般为5、7、10μm。2019/10/4对填料的要求填料的种类制备柱的装填技术干装法匀浆法压缩法使用最多的就是硅胶及其衍生物的键合固定相填料近年来又发展了整体柱色谱。动态轴向压缩法(DAC)填装的色谱柱柱床均匀、性能稳定、柱效高。目前，DAC柱己基本上主宰了整个制备型色谱柱市场，柱径己从25mm发展到1.6m。2019/10/4•1.制备型HPLC的样品预处理在高压液相色谱进样之前,需对样品进行过滤。使用能套在注射器上的滤片可以除去样品中混有的颗粒状杂质,既方便又廉价。在选用过滤膜时应注意使其适合于所用的溶剂,这一点在使用含四氢呋喃的溶剂时尤其重要。在色谱柱与进样器之间安装前置柱可除去颗粒状杂质和吸附性强的样品组分。前置柱通常装有少量与色谱柱相同的填料,如填充得当,对系统分离效果不会造成很大影响。硅胶预处理柱可防止含有缓冲盐或碱的流动相所引起的麻烦,上诉物质可破坏键合相填充料的硅胶骨架,常会在柱的上部形成空隙。预处理柱安装在泵与进样器之间,这样尽管流动相被硅胶所饱和,但在进样途中不会有空隙或气泡。3应用与实例应用与实例2019/10/42制备规模按照分离一次进样量的多少,制备型HPLC有3种规模,即半制备级HPLC、克级HPLC和工业级HPLC,如下表所示制备型HPLC以生产纯物质为目的,在经济合理的前提下,规模越大越好2019/10/43柱超载方式分析型HPLC与制备型HPLC的根本区别在于分离目的不同。在制备型HPLC中,为了节省投资和操作费用,必须以最少的时间生产最大量的产品。为了提高制备量,柱必须超载。柱的超载方式有两种,一种是所谓的“质量超载”,即维持较小的进样体积,但提高进样浓度;另一种是所谓的“体积超载”,即保持较小的进样浓度,但增加进样体积。在制备型HPLC中,一般认为采用质量超载的方式较好。王志祥等人建立的混合池模型可以较好的描述制备型HPLC分离过程,发现在制备型HPLC分离过程中,分离度和柱效均随质量超载程度的增加而下降。但是,在分离度可以满足分离要求的前提下,采用质量超载的方式操作,可以提高制备量。2019/10/44流动相进行制备型液相色谱分离时,所用溶剂的纯度很重要。即使含纯化合物的流动相溶剂中含有微量的不挥发性杂质当大量溶剂经蒸发后,其杂质浓度就会增高。制备型液相色谱往往需消耗大量溶剂,因此应在溶剂纯度与所用数量之间进行权衡。流动相中的非挥发性添加剂会在产物回收时引起麻烦,这是可采用挥发性缓冲物来改进分离效果,又易于将其除去。5洗脱制备型HPLC所采用的洗脱方式主要有两种。一种是维持流动相的热力学参数不变的等度洗脱法;一种是改变流动相的一种或几种热力学参数的梯度洗脱法。2019/10/46被分离物质的收集在制备型分离工作中,需使用大量的洗脱溶剂,因此要采用适当的收集器。如有可能,应对溶剂回收再用,因而也应尽量不使用混合溶剂。在使用反相或聚合物吸附剂进行分离时,有时从水液中回收样品较困难。一种解决办法是蒸除其中的有机溶剂,然后用甲苯或氯仿提取残留水液。如以甲醇-水为洗脱液,可将收集的流分用水稀释5倍,用泵加回到色谱柱上,然后用甲醇将化合物洗脱下来。如从环肽中脱盐时,先用水洗脱重新加到柱上的流分,然后用纯甲醇洗脱所需成分另一种方法是将收集的样品加到SephadexLH-20柱上,如Seto等在从植物蔷薇中分离黄酮苷时,采用此法以水洗除HPLC洗脱液中含有的磷酸,而后用甲醇将纯化合物洗下。2019/10/47.实例标准品的制备实例：茶氨酸、苯乙醇苷类、罗汉果甜苷Ⅴ等样品的分离纯化实例：绿原酸、大豆异黄酮等药物杂质研究制备型HPLC是制备纯化杂质的一种很有效的手段。2019/10/4实例：标准品的制备•茶氨酸是影响茶叶品质的重要组成部分,约占茶叶中游离氨基酸的40%以上，占茶叶干重的1～2%。药理学研究表明茶氨酸能拮抗咖啡碱引起的神经系统兴奋,同时具有降压作用。目前,仅日本有少量的茶氨酸对照品,且价格较贵,限制了对其进一步的研究与应用。肖伟涛等采用制备高效液相色谱技术分离纯化茶氨酸对照品,纯度达到98%以上,制备收率大于60%。方法简便,生产周期短、费用低。茶氨酸产品可用作分析方法的对照品。•苯乙醇苷类化合物为传统补益中药肉从蓉的有效成分,该类化合物有明显提高记忆功能、抗衰老、助阳等作用。松果菊苷是肉从蓉中含量较高的一种苯乙醇苷类化合物,在以管花肉从蓉为原料制成的国家级二类新药--苯乙醇总苷中其质量分数高达48%。但目前国内外还未见有松果菊苷标准品出售。雷厉等利用反相制备高效液相色谱法从管花肉从蓉的乙醇提取物中纯化制备了松果菊苷的标准品,纯度达到98%以上该方法操作简便,重现性好,可用于松果菊苷及其它苯乙醇苷类化合物的大量制备。2019/10/4实例：标准品的制备•罗汉果甜苷Ⅴ(mogrosideV)我国传统出口商品罗汉果中的主要甜味成分,具有甜度高、热量低、水溶性好等优点。药理研究表明,罗汉果甜苷Ⅴ具有镇咳、祛痰以及增强免疫等功效。但目前市场上还没有罗汉果甜苷Ｖ的标准品出售。余丽娟等利用半制备高效液相色谱法得到罗汉果甜苷Ｖ标准品,纯度达98.5%。方法具有操作简便、重现性好、产品纯度高等优点。为研究mogrosideV单体的活性及体内药物学过程提供了方便,也为制备其他罗汉果三萜苷类标准品提供了有益的参考。以甜苷Ｖ作为罗汉果中的含量测定的指标,对于确定罗汉果品质的好坏、指导罗汉果的收购和罗汉果甜苷产品的生产具有重要意义。2019/10/4实例：样品的分离纯化•绿原酸具有抗菌、抗病毒、利胆、增高白血球及兴奋中枢神经系统等功效。国外多以咖啡豆和金银花为原料提取绿原酸。有实验结果表明,杜仲叶片中绿原酸的含量与金银花的相当,而且资源丰富,价格低廉。目