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，徐增辉2，钱其军1,2*1浙江理工大学生命科学学院，杭州(310018)2第二军医大学东方肝胆外科医院，上海(200438)E-mail:lqg127@sina.com摘要：由于腺相关病毒(Adeno-associatedViruses,AAV)的非致病性及能感染多种组织类型，重组AAV载体（rAAV）在基因治疗领域备受关注。然而，如何有效生产rAAV以适应临床上对其高产量的需求一直是个较大的瓶颈。借助杆状病毒携带rAAV包装所需组分，通过感染昆虫细胞来生产rAAV是一种能够解决其产量瓶颈的生产方式。将AAV2的Rep、Cap基因序列以及含AAV2ITR及EGFP表达框的序列分别构建到三个杆状病毒中，通过共感染Sf9细胞来生产rAAV，结果显示成功包装出rAAV病毒，且病毒活力较好。这种生产方式很容易放大，将为AAV载体产业化及临床应用奠定重要基础。关键词：rAAV；杆状病毒；病毒生产1.引言腺相关病毒（Adeno-associatedVirus,AAV）是细小病毒(parvovirus)家族中依赖病毒属（Dependovirus）中的一员，昀早于1965年作为腺病毒制备物中的一种污染成分被发现[1]，其复制性感染需要在腺病毒或单纯疱疹病毒的辅助下才能发生。AAV2基因组为单链线性DNA，大小为4.7kb左右，包含2个开放阅读框(ORFs)，左边RepORF的四个产物Rep78、Rep68、Rep52和Rep40主要负责病毒的位点特异性整合、复制和转录调控等；右边CapORF的三个产物VP1,VP2和VP3主要负责病毒颗粒的装配，构成AAV的外壳并将AAV单链DNA基因组包裹在壳内形成成熟的AAV病毒颗[2][3]。AAV基因组的两端各有一个145bp的末端重复序列(ITR)，其中靠近末端的125个碱基是一个较长的回文结构，自身能通过碱基互补配对进行折叠，使得ITR呈现出T字型的发卡结构，是AAV复制和包装所需的唯一顺式作用元件[4]。rAAV只保留了两端的ITR序列，AAV的Rep及Cap基因由外源基因表达框替代。在生产rAAV时，只要提供Rep和Cap蛋白的反式功能以及其它辅助病毒的辅助功能，带有外源基因的重组AAV基因组就会被营救、复制并包装成rAAV病毒[5]。然而，临床上对AAV载体的产量要求是比较高的，难以获得一种简单、易放大、安全性较好的高产量生产方式是阻碍其应用于基因治疗的一个重大瓶颈。由于杆状病毒不像腺病毒和单纯疱疹病毒那样会对人体产生毒性，昀近基于杆状病毒-昆虫细胞的rAAV生产系统引起了广泛关注。杆状病毒-昆虫细胞生产系统需要以下两类反式组分：两个复制蛋白Rep78、Rep52以及三个外壳蛋白VP1、VP2、VP3。Urabe等[6]首次采用三个杆状病毒感染昆虫细胞来探索rAAV的生产，单个细胞的产量达到5×104个rAAV，且性质与传统的哺乳动物细胞产生的rAAV没有区别。我们在Urabe等人研究结果的基础上，合理改进杆状病毒载体，将Rep78与Rep52分开，分别与其它的Cap基因组合，这样避免了由于Rep78与Rep52的同源性造成重组杆状病毒的不稳定。在构建三个杆状病毒Bac-AAV2Rep78Cap2+3,Bac-AAV2Rep52Cap1和Bac-AAV2EGFP后，通过共感染Sf9昆虫细胞来生产带EGFP的重组AAV。1本课题得到国家自然科学基金(No.30772477)的资助。、p5E18-VD286和pAAV2-neo-EGFP由本实验保存；pFastBacDual载体、DH10Bac™大肠杆菌感受态、Purelink™Hipure质粒纯化试剂盒、Sf9昆虫细胞、Cellfectin®转染试剂、Sf-900IISFM无血清培养基购自Invitrogen公司；293T细胞购自ATCC；KOD-Plus聚合酶及SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒购自TOYOBO公司；各种内切酶及DNAMarker购自NEB公司；RNA酶、SolutionI连接酶购自Takara公司；Nucleospin胶回收试剂盒购自Macherey-Nagel公司；蛋白酶K、QiaAmpDNABloodMiniKit购自QIAGEN公司；FBS、DMEM培养基及胰酶购自GIBCO公司。2.2方法2.2.1载体构建首先合成以下引物（划线部分为内切酶识别位点）：1CCGCTCGAGATGGAGCTGGTCGGGTG2CCGCTCGAGATGCCGGGGTTTTACG3CTAGCTAGCTTATTGTTCAAAGATGC4GGACTAGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTC5GGACTAGTACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGC6GCTCTAGAGCAATTACAGATTACGAGTC以含AAV2基因组的质粒pSH3为模板，用引物1和3扩增Rep52基因序列，引物2和3扩增Rep78基因序列，Xho &Nhe 双酶切后分别经Solution 连入经相同酶切的pFastBacDual载体，得到pFBD-AAV2Rep52和pFBD-AAV2Rep78；然后以pSH3为模板，用引物4和6扩增Cap1基因序列，引物5和6扩增Cap2+3基因序列，Spe &Xba 双酶切后分别经Solution 连入经相同酶切的载体pFBD-AAV2Rep52和pFBD-AAV2Rep78，连接产物经多种酶切鉴定并送测序正确后，得到两个重组载体pFBD-AAV2Rep52Cap1和pFBD-AAV2Rep78Cap2+3（图1(a)(b)）。图1构建的三个重组pFBD载体示意图Figure1SchematicrepresentationofthreerecombinantpFBDvectors然后合成两条引物，经退火后形成两端为Xho 和EcoR 粘性末端的Linker，该Linker内部引入了Apa 识别位点。首先将Linker连入经Xho &EcoR 双酶切的pFastBacDual载体，去掉内部PPH及P10两个启动子，得到pFastBacDual-Linker，然后用Apa 、Sma 分步酶切，回收后一端是Apa 的粘性末端，一端是平末端；Apa 、Hpa 分步酶切质粒pAAV2-neo-EGFP，回收2454bp的片段，该片段包含AAV2的两个ITR及EGFP的表达框，一端是Apa 的粘性末端，一端是平末端，将该片段连入上面经酶切的pFastBacDual-Linker，中国科技论文在线连接产物经酶切鉴定正确，命名为pFBD-AAV2EGFP（图1(c)）。2.2.2转座重组及重组Bacmid的提取将构建好的重组载体pFBD-AAV2Rep52Cap1、pFBD-AAV2Rep78Cap2+3和pFBD-AAV2EGFP分别转化DH10Bac™感受态，涂布于含Kan终浓度50ug/ul、Gen7ug/ul、Tet10ug/ul、X-gal100ug/ul、IPTG40ug/ul的平板，48小时左右挑取白色菌落重新划线，待长出白色菌落后接种于含相应抗生素的LB培养基中，用Purelink™Hipure质粒纯化试剂盒提取重组Bacmid，用前面扩增Rep及Cap基因的引物进行PCR鉴定正确后，得到三种重组Bacmid：Bacmid-AAV2Rep52Cap1、Bacmid-AAV2Rep78Cap2+3及Bacmid-AAV2EGFP。2.2.3重组杆状病毒的包装及滴度测定Sf9细胞用Sf-900IISFM无血清培养基置于27℃培养箱培养，当细胞生长至相互汇合时，将细胞直接吹起，离心重悬后计数；按9×105/孔加入到六孔板中，贴壁后加入2µg的重组Bacmid和6µL的Cellfectin®转染试剂，5小时后移去转染试剂，加入2ml的SF-900IISFM无血清培养基，48小时后置于荧光显微镜下观察Bacmid-AAV2EGFP转染所在孔的绿色荧光表达情况以判断转染效果；72小时左右观察到细胞有感染迹象时，用15ml的离心管收集孔板中含重组杆状病毒的培养液，500×g离心5分钟以去除细胞及较大的碎片，收集上清即得到P1代重组杆状病毒Bac-AAV2Rep52Cap1、Bac-AAV2Rep78Cap2+3及Bac-AAV2EGFP。在获得以上四个重组杆状病毒后，用QIAGEN公司的DNABloodMiniKit提取重组杆状病毒DNA后，利用荧光定量PCR测定杆状病毒的滴度。针对Rep基因序列设计特异性引物（正向：ACGGGAAAGCACTCTAAACA，反向：CGATCAACTACGCAGACAGG），用含AAV2Rep基因的质粒p5E18-VD286作为杆状病毒Bac-AAV2Rep52Cap1以及Bac-AAV2Rep78Cap2+3的标准品；针对EGFP序列设计特异性引物（正向：GCAGAAGAACGGCATCAAGG，反向：CGGACTGGGTGCTCAGGTAG），用质粒pAAV2-neo-EGFP作为杆状病毒Bac-AAV2EGFP的标准品，标准品分别经10倍梯度稀释后与样品一起进行标准曲线实验，根据标准曲线计算出相应杆状病毒的病毒基因组滴度（VG/ml）。2.2.4rAAV的生产于10cm的Dish中加入1×107个Sf9细胞，贴壁后按MOI值50VG/cell加入杆状病毒Bac-AAV2Rep52Cap1、Bac-AAV2Rep78Cap2+3和Bac-AAV2EGFP；三天左右后，将Sf9细胞及培液一起收集到15ml的离心管中，2500rpm离心5分钟去除上清，细胞沉淀用3ml的无血清DMEM重悬，-80℃冰箱及37℃水浴反复冻融3到4次，10,000×g离心10分钟，收集上清即得到rAAV病毒，60℃加热30分钟以灭活杆状病毒，-80℃保存。2.2.5rAAV的病毒活性检测293T细胞用DMEM+10%FBS置于37℃5%CO2培养箱培养，当生长至80%汇合度时，0.25%胰酶消化后计数，每孔3×105铺于六孔板中，贴壁后加入100ul的rAAV病毒，每隔一段时间后置于荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况。为模板，用引物2和3扩增Rep78基因序列，引物1和3扩增Rep52基因序列，结果显示扩增出1865bp的Rep78片段（图2孔1）以及1193bp的Rep52片段（图2孔2）；以pSH3为模板，用引物4和6扩增Cap1基因序列，引物5和6扩增Cap2+3基因序列，结果显示扩增出2221bp的Cap1片段（图2孔3）和1800bp的片段（图2孔4）。图2AAVRep和Cap基因的PCR扩增Figure2PCRamplificationofAAVrepandcapsequencesM:DNAMarker;1:Rep78PCR;2:Rep52PCR;3:Cap1PCR;4:Cap2+3PCR3.2重组pFBD载体的酶切鉴定在构建好生产重组AAV所需的三个重组pFBD载体后，分别采用酶切进行鉴定，切出的条带大小与预期一致（图3），证明质粒构建正确，可用于下一步转座重组构建重组Bacmid。图3重组pFBD载体的酶切鉴定Figure3IdentificationofrecombinantpFBDvectorsbyrestrictionenzymedigestionM:DNAMarker;1:pFBD-AAV2Rep52Cap1withNco1&Xba1;2:pFBD-AAV2Rep52Cap1withNco1&Kpn1;3:pFBD-AAV2Rep78Cap2+3withNco1&Xba1;