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任务1-2谷氨酸生产菌1234谷氨酸生产菌●国内谷氨酸生产菌特性比较●谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化●谷氨酸发酵的代谢控制育种策略●56菌种的扩大培养及种子的质量要求●菌种的保藏与复壮一、谷氨酸生产菌种类与特征一）现有谷氨酸生产菌的分类现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。1.棒状杆菌属(Corynebacterium)直到微弯的杆菌，一端膨大呈棒状，折断分裂形成“八”字形或栅状排列。葡萄糖发酵产酸，G+2短杆菌属(Brevibacterium)短的不分枝直杆菌。多数从葡萄糖发酵产酸，不发酵乳糖。G+3小杆菌属(Microbacterium)形态与棒状杆菌相似。发酵葡萄糖产酸弱，主要产乳酸。G+4节杆菌属(Arthrobacterium)培养过程中，细胞形态变化较大球菌杆菌，杆菌球菌。G+G-,G-G+二）谷氨酸生成菌的主要特征（1）细胞形态球形、棒状以及短杆状。（2）G+，无芽孢、无鞭毛，不能运动。（3）需氧型、生物素缺陷型微生物。（4）脲酶强阳性（5）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白以及明胶。（6）发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化。（7）CO2固定反应酶系活力强。（8）异柠檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循环弱。（9）α-酮戊二酸氧化能力微弱。（10）NADPH2进入呼吸链能力弱。（11）柠檬酸合成酶、乌头酸梅、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强。（12）能利用醋酸，不能利用石蜡。（13）具有向环境中泄露谷氨酸的能力。（14）不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸，产谷氨酸5%以上。二、国内谷氨酸生产菌特性比较1、形态特征短杆至小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，呈多种形态。单个、成对及“V”字形排列。G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。一）北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征2、培养特征普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，24h白色，48h淡黄色，中央隆起，表面湿润、光滑，有光泽，边缘整齐且呈半透明状，无黏性，不产生水溶性色素。3、生理特征★对氧的要求：好氧及兼性厌氧。★与温度的关系：菌株26~37℃培养生长良好，不耐高温，41℃生长较弱。★pH的影响：Ph5~10均能生长，最适pH6~7.5。★还原硝酸盐：反映强烈。★石蕊牛奶培养：7d后微产碱。★不水解淀粉，不分解纤维素。★对尿素的耐力，2.6%以上生长受抑制。★脲酶试验：强阳性反应。★产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖迅速产酸。★生长因素试验：生物素是必需生长因素。硫胺素明显促生长。二）钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征1、形态特征短杆至棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝。单个、成对及“V”字形排列。折断分裂。G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。2、培养特征普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，近草黄色，表面湿润、光滑，无光泽，边缘顿齿状，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。★对氧的要求：兼性厌氧。★与温度的关系：菌株20~37℃培养生长良好，不耐高温，42℃不生长。★pH的影响：pH6~9生长良好，pH10生长微弱，pH4~5已不能生长。★还原硝酸盐：反映强烈。★石蕊牛奶培养：7d后微产碱。★水解淀粉，不分解纤维素。★对尿素的耐力，2.6%以上生长受抑制。★脲酶试验：强阳性反应。★产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵等迅速产酸。★生长因素试验：生物素是必需生长因子。3、生理特征三）天津短杆菌(T613)的形态和生理特征典型的短杆状，有时微弯曲，两端稍钝圆，不分枝。单个、成对及“V”字形排列。折断分裂。G+。不运动。无芽孢。1、形态特征2、培养特征★普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，浅黄色，表面湿润、光滑，隆起，边缘整齐，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。3、生理特征★对氧的要求：好氧及兼性厌氧。★与温度的关系：菌株26~37℃培养生长良好，75℃处理10min不再生长。★pH的影响：pH6~10生长良好，pH5生长微弱，pH4和pH11已不能生长。★还原硝酸盐：反映强烈。★不水解淀粉，不分解纤维素。★对尿素的耐力，5%以上生长受抑制。★脲酶试验：强阳性反应。★产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵★生长因素试验：生物素是必需生长因子。硫胺素是促生长作用。四）北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较菌种细胞大小细胞形态等电点菌落颜色生物素用量生长因子发酵周期噬菌体类型7338小变化不大pH3.0-4.2接近谷氨酸结晶等电点乳白色4-5ug/L生物素和硫胺素长感染噬菌体的类型不同，不会交叉感染B9大伸长膨大不在该pH范围草黄色5-8ug/L生物素短后提取容易，收率较高，质量较好分泌色素较多2.5天津短杆菌(T613)与钝齿杆菌(B9)的比较菌种细胞大小细胞形态等电点菌落颜色生物素用量糖酸转化率发酵温度噬菌体类型T613小变化更大pH3.0-4.2接近谷氨酸结晶等电点淡白色较B9低20-50%高前期32-34℃中后期36-38℃交叉感染B9大伸长膨大不在该pH范围草黄色5-8ug/L低前期30-32℃中后期34-35℃T613感染噬菌体时，不能换用B9，调换7338.三、谷氨酸生产菌的筛选什么是筛选？如何筛选？1.采样在哪采？如何采？？？？？？2.分离分离什么？？？？？？？？？3.初筛鉴别！！！！！！！！！！！4.复筛产量！！！！！！！！！！！5.发酵实验黄色短杆菌北京棒杆菌杆状细菌四、菌种选育谷氨酸菌体的选育方法主要有五种，自然选育、诱变选育、杂交选育、代谢控制选育和基因工程选育。一）自然选育以基因自发突变为基础。有利于谷氨酸产生菌保持纯系良种，使谷氨酸生产具有相对稳定性，提高发酵水平。缺点：菌体自身存在着修复机制和某些酶的校正作用，使得自发突变率极低，导致选育耗时长、工作量大、效率低。也称自然分离，是指对微生物细胞群体不经过人工处理而直接进行筛选的育种方法。二）诱变选育物理因素：紫外线、60Co、X射线、γ-射线、快中子、α-射线、β-射线、超声波、He-Ne激光辐照、离子束等。化学因素：氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基甲基脲、亚硝酸、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶等。其它因素：生物诱导因子，如噬菌体诱发抗性突变等。例：王岁楼；张一震；李志。谷氨酸高产菌TZ-310的诱变选育及其发酵的研究。中国调味品，1997年09期。摘要：以天津短杆菌Ｔ６-１３为出发菌株，经６０Ｃｏ—γ射线、紫外线和硫酸二乙酯复合诱变并经高温驯化，获得一株琥珀酸和生物素双营养缺陷型突变株。该菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸（ＧＡ）、不分解利用ＧＡ及耐高温（３８℃～４５℃）的优点。原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，制得原生质体或原生质球，在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG)助融，促使原生质体凝集、融合，两个基因组之间接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体。三）杂交育种杂交育种常规杂交原生质体融合谷氨酸产生菌的前处理因为其有着特殊的细胞壁结构，对溶菌酶一般不敏感。方法：加入EDTA（乙二胺四乙酸）、甘氨酸、青霉素和D-环丝氨酸等，这些物质可以使细胞壁变得疏松，便于溶菌酶处理。如，李蒲兴等将6株谷氨酸产生菌以甘氨酸、青霉素和溶菌酶的不同组合处理，对其原生质体形成进行比较，在最佳条件下，原生质体形成率可达95％～100％。张蓓等以谷氨酸产生菌天津短杆菌T6-13为出发菌株，获得了具有目的遗传标记寡霉素抗性(Orm)和氟乙酸抗性(FEAr)的突变株TN63和TN115。然后，分别以TN63和TN115为亲株，通过原生质体融合，获得了具有Orm+FEAr标记的融合子FTN9108，其原生质体融合频率为2.6×10-3。OrmFEAr+OrmFEArOrmFEAr四）代谢控制选育以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量生成积累。Glu产生菌诱变育种突变株代谢控制发酵大量积累Glu1.选育耐高糖、高谷氨酸的菌株如选育在含20％～30％葡萄糖的平板上生长良好的耐高糖突变株；在含15％～20％味精的平板上生长良好的耐高谷氨酸突变株；在20％的葡萄糖加15％味精的平板上生长良好的耐高糖、耐高谷氨酸的菌株。2.选育能强化谷氨酸合成代谢、削弱或阻断支路代谢的菌株（1）选育不分解利用谷氨酸的突变株选育在以谷氨酸为唯一碳源培养基上不长或生长微弱的突变株。谷氨酸谷氨酰胺鸟氨酸瓜氨酸精氨酸（2）选育强化CO2固定反应的突变株a.选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源，生长良好的菌株。因为细胞内碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反应，该反应与C02固定反应是相同酶所催化，C02固定反应相应地加强。b.选育氟丙酮酸敏感突变株。因为氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，即抑制丙酮酸向乙酰CoA转化，相应地CO2固定反应加强。突变株对氟丙酮酸越敏感，效果越理想。c.选育减弱乙醛酸循环的突变株。乙醛酸循环减弱不仅能使C02固定反应比例增大，而且异柠檬酸也能高效率地转化为α-酮戊二酸，再生成谷氨酸。常见的该突变株有琥珀酸敏感型突变株和不分解利用乙酸的突变株。（3）选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株有酮基丙二酸抗性突变株、谷氨酸结构类似物抗性突变株和谷氨酰胺抗性突变株。草酰乙酸谷氨酸转氨酶天冬氨酸+α-酮戊二酸谷氨酸α-酮戊二酸NH3谷氨酸脱氢酶（4）选育强化能量代谢的突变株原因：使TCA循环前一段代谢加强，谷氨酸合成速率加快。a.选育呼吸链抑制剂抗性突变株如可选育丙二酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株来实现。b.选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株如可选育2,4-二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株来实现。c.选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株如可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。（5）其它遗传标记选育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶类似物、抗核苷酸类抗生素、异亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、AEC抗性、AHV抗性、棕榈酰谷氨酸等突变株，都可以不同程度地提高谷氨酸产量。3.选育能提高谷氨酸通透性的菌株（1）选育生物素缺陷型菌株。（2）选育油酸缺陷型菌株。（3）选育甘油缺陷型菌株。（4）选育温度敏感型突变株突变位置发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构的基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱基所置换，这样为基因所控制的酶在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变。另一个特点是在生物素丰富的培养基上也能分泌出谷氨酸。(5)其它突变型菌株抗药性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙酸缺陷型、棕榈酰谷氨酸敏感型突变株等，都能增强谷氨酸的通透性。五）基因工程选育基因工程育种是指利用基因工程方法对产生菌株进行改造而获得高产工程菌，或者是通过微生物间的转基因而获得新菌种的育种方法。载体系统：一般以质粒、噬菌体或转座子作为载体，尤以质粒为多。受体系统：受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株。供体菌株：供体菌株选择短杆菌属及棒杆菌属的野生菌或变异株。工具酶：切割供体DNA和载体DNA的工具酶——限制性内切核酸酶有许多种，HindⅢ、BclI、XbaI和XamI效果最好。载体系统受体系统供体菌株工具酶谷氨酸产生菌的许多关键酶的基因已被克隆，Ozaki等克隆了谷氨酸棒杆菌的分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶基因，通过质粒载体导回谷氨酸棒杆菌，产量提高了50％。周盛等从大肠杆菌E.colik-12中通过PCR克隆出磷酸果糖激酶编码基因(pfkA)，将其连到表达载体，连接构建成重组质粒pKu-1，转化谷氨酸棒杆菌B4，并得到表达；酶活性测定表明pf-kA基因表达活力为128.6±o.86u／g的蛋白。同时，转化子菌株对糖转化率比B4高10.64％，产酸率比B4高17.1％。五、菌种保藏与复壮保藏原理：挑选优良品种，抑制微生物的代谢活性，创造休眠环境。保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便。保藏后使用前需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)。一）保藏方法(1)低温冷冻保藏；(2)