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第五章发酵工业的灭菌及空气除菌第一节消毒与灭菌第二节发酵工业的无菌技术第三节培养基与发酵设备的灭菌第四节空气的除菌目的要求：了解灭菌对发酵工业的意义，灭菌的原理及常用的方法。掌握培养基及发酵设备的灭菌方法。了解生产中空气除菌的基本方法、原理及设备。理解空气净化流程。几个问题1、灭菌对发酵的意义2、灭菌的原理3、灭菌的方法4、灭菌的对象5、空气的灭菌灭菌的目的及内容目的：为了保证纯种并安全发酵内容：培养基补料液（流加料）发酵过程的无菌控制空气系统直接关系到发酵罐生产的成败!管道系统环境：需要消毒第一节消毒与灭菌一、控制有害微生物的主要措施二、几个概念（一）灭菌（二）消毒（三）防腐（四）化疗（一）灭菌（sterilization）灭菌：（p128）采用理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。Sterilization就是失去繁殖力。例如各种高温灭菌措施等。灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象。（二）消毒从字义上来看，消毒就是消除毒害，这里的“毒害”就是指传染源或致病菌的意思。消毒:是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。（三）防腐（antisepsis）防腐:就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。（1）低温（2）缺氧（3）干燥（4）高渗（5）高酸度（6）防腐剂（四）化疗（chemotherapy）化疗:即化学治疗。它是利用具有高度选择毒力（即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成分等。第二节发酵工业的无菌技术常用的除菌方法（p128-129）一、高温灭菌：干热灭菌和湿热灭菌。火焰灭菌：接种时用。二、射线灭菌：用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法。三、化学药剂灭菌：一些化学药剂能与微生物反应而具杀菌作用。适用于环境、设备等方面的消毒，一般不用于培养基的灭菌。四、过滤除菌：利用过滤方法阻留微生物，达灭菌目的。适用于澄清流体（如气体和液体）的除菌以及热敏性培养基的除菌。一、高温杀菌（一）高温致死原理（二）高温灭菌的方法（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止（四）灭菌设备（一）高温致死原理高温使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏。例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。（二）高温灭菌的方法1．干热灭菌法干热灭菌法：将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热干燥箱内，在160～170℃下维持1～2h后，即可达到彻底灭菌的目的。原因：在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。适用对象：玻璃器皿、金属材料、耐高温物品。灼烧：是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。2．湿热灭菌法湿热灭菌法：利用饱和蒸汽进行灭菌的方法。湿热灭菌法与干热灭菌法的比较：湿热灭菌法比干热灭菌法更有效，这一方面是由于湿热易于传递热量，另一方面是由于湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。方法：常压和高压。微生物的耐热情况：多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5～10min后即可杀死；酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80℃以上的温度处理才能杀死；细菌的芽孢最耐热，一般要在121℃下处理15min才能杀死。（1）常压法巴氏消毒法：用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它们的风味。它是一种低温消毒法。低温维持法：在63℃下保持30min可进行牛奶消毒；高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在72℃下保持15秒钟即可。间歇灭菌法：又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。方法：将待灭菌的培养基在80～100℃下蒸煮15～60min，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37℃下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。用途：适用于不耐热培养基的灭菌。（2）加压法常规加压灭菌法:将盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽气体后将锅密闭。分为两种具体的方法：①再继续加热至121℃（压力为1kg／cm2或15磅／英寸2），时间维持15～20min；②或采用在较低的温度115℃，（即压力为0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下维持35min。用途：一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。连续加压灭菌法——“连消法”用途：只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。方法：培养基一般在135～140℃下处理5～15秒钟以达到灭菌的目的。连续加压灭菌法优点：①因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，比“实罐灭菌”（121℃，30min）提高产量5～10％；②由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率；③由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；④适宜于自动化操作；⑤降低了操作人员的劳动强度。影响加压蒸汽灭菌效果的因素（1）灭菌物体含菌量的影响（2）灭菌锅内空气排除程度的影响（3）灭菌对象pH的影响（4）灭菌对象的体积（5）加热与散热速度（1）灭菌物体含菌量的影响天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成的培养基，一般含菌量较高，而用纯粹化学试剂配制成的组合培养基，含菌量低。（2）灭菌锅内空气排除程度的影响检验灭菌锅内空气排除度，可采用多种方法。最好的办法是灭菌锅上同时装有压力表和温度计，其次是将待测气体通过橡胶管引入深层冷水中，如只听到“扑扑”声而未见有气泡冒出，也可证明锅内已是纯蒸汽了。（3）灭菌对象pH的影响（4）灭菌对象的体积要防止用常规的压力和时间在加压灭菌锅内进行大容量培养基的灭菌。（5）加热与散热速度这两段也对灭菌效果和培养基成分发生影响。为了使科学研究的结果有良好的重演性，在灭菌操作中对这些技术细节都应加以注意。（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止消除高温有害影响的措施：（1）采用特殊加热灭菌法（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并。（3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀。（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下灭菌15min）或间歇灭菌。（5）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌。1.高压蒸汽灭菌设备2．常压蒸汽灭菌锅（四）灭菌设备1.高压蒸汽灭菌设备手提式灭菌锅：容量小，多用于母种培养基灭菌。立式或卧式灭菌锅：较大，多用于原种或少量栽培种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。灭菌柜：要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)。但投资太大，适合大型菌种场使用。2．常压蒸汽灭菌锅常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适于一般生产单位和专业户使用。大小可根据需要而定，但最大的锅每次装料也最好不超过500Kg。3．烘箱烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。二、射线灭菌射线灭菌：是用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法。常用的方法：波长为2537A°的紫外线，多用于表面及空气消毒。0.06～1.4A°的X射线。C060产生的γ射线。微波灭菌等。三、化学杀菌剂或制菌剂（一）表面消毒剂表面消毒剂：是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞内的化学治疗用的化学药剂。常用消毒剂的种类很多，它们的杀菌强度各不相同。但几乎都有一个共同规律，即当其在极低浓度时，常常会对微生物的生命活动起刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。适用：环境以及物体表面的消毒．（二）石炭酸系数为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强度，常采用在临床上最早使用的消毒剂——石炭酸作为比较的标准，并提出了石炭酸系数这一指标。石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10min，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。四、过滤除菌过滤除菌：将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。适用：澄清流体（如气体和液体）的除菌热敏性培养基的除菌工业生产中用于制备无菌空气产品提取过程中处理料液而获得无菌产品（尤其适合对热不稳定的物质）。在实际生产中，以上几种方法有时根据情况可结合使用。如制备培养基时，其中一些成分对热敏感（如氨基酸、维生素等）就要用过滤方法除菌。而其它物质可用蒸汽灭菌，最后合并使用。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。滤膜过滤装置:烧结玻璃滤板过滤器、石棉板过滤器（Seitz滤器）、素烧瓷过滤器以及硅藻土过滤器等。过滤除菌的缺点：是无法去除其中的病毒和噬菌体。常见的过滤器滤膜孔径：0.22、0.45µm。可以拦截的微生物：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。除病毒需要的滤膜孔径：0.04µm。醋酸纤维素膜过滤器拦截的大肠杆菌图片板式膜分离器（实验室用）中空纤维膜分离器（实验室用）中空纤维膜分离器（工业用）第三节培养基与发酵设备的灭菌培养基与设备灭菌的方法（p129-137）——高压蒸汽湿热灭菌法一、湿热灭菌的基本原理二、影响培养基灭菌的因素三、灭菌的实际操作原理：湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌。蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：杀死全部微生物所需的时间。由于湿热灭菌有经济和快速等特点，因此被广泛用于工业生产。一、湿热灭菌的基本原理用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求:既要达到一定的灭菌程度。又要尽量减少营养成分的破坏。（一）理论灭菌时间某些分子的分解和分子内部的重新排列的反应属于单分子反应。杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属于单分子反应，因此，杂菌在一定温度下受热死亡也遵循单分子反应方程。微生物受热死亡的定律——对数残留定律：计算灭菌时间的基本公式——对数残留方程：t=(2.303/k)·log(No/Nt)t---灭菌时间（s）k---灭菌反应速度常数，与菌的种类和灭菌温度有关（s－１）No---灭菌开始时，培养基中杂菌个数（个／ml）---经过灭菌时间t后，残存活菌个数（个／ml）灭菌时间与污染程度（No）、灭菌程度（Nt）和灭菌反应速度常数（k）有关。灭菌时间和温度呈反比关系。（p130）（二）灭菌温度与灭菌反应速度常数的关系灭菌温度与灭菌反应速度常数的关系——阿仑乌斯定律：k=Ae-E/RTK——灭菌反应速度常数（s-1）A——阿仑乌斯常数（s-1）E——活化能（J／mol）R——气体常数4.1868×1.98J／（mol·K）T——绝对温度（K）灭菌温度越低，K值越小，灭菌时间越长；反之，灭菌温度越高，K值越大，则灭菌时间越短。（p130-131）杀死细菌和芽孢