EdU流式分析说明书

1/3EdU细胞增殖流式检测使用说明RN:R11056.5产品简介EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU与T非常相似，而EdU染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等），可有效避免样品损伤，而且无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。试剂盒内容运输与保存室温运输，4˚C储存，勿冻存，荧光试剂请避光保存，可稳定储存一年。实验准备•6孔培养板或培养皿•1XPBS(pH7.2~7.6)注：请使用一次性手套，废液请妥善处理。试剂浓度FlowCytometryC10338EdU溶液(试剂A)1000X20μLApollo®反应缓冲液(试剂B)20X500μLApollo®催化剂溶液(试剂C)100X100μLApollo®荧光染料溶液(试剂D)300X30μLApollo®缓冲添加剂(试剂E)粉末100mgHoechst33342(试剂F)100X150μL2/3实验参考表1EdU培养基及染色反应液的使用量参考表2EdU孵育时间设定参考注：1）EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2h孵育时间；2）*考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等因素的影响，细胞的增殖情况可能会有所变化。表3Apollo®染色反应液的配置参考（现用现配）注：1）由于染色反应液用量较少，但又需要现用现配，*通常配制的Apollo®反应液的体积；2）按顺序配制适量1XApollo®染色反应液，以免破坏正常的反应体系(现用现配，30分钟用完)；3）试剂E为白色粉末，较易氧化，使用后请旋紧管盖；粉末较难准确称量，称量误差范围可稍微放宽，但不应超过±20%。表4配套染料的相关波长信息注：1）试剂盒包括Hoechst33342染料和1种Apollo荧光染料；2）流式细胞仪检测宜采用Apollo®488荧光染料，能够兼容荧光显微镜和大多数流式细胞仪；3）如果流式细胞仪有自动数细胞的功能，则可以不染Hoechst33342。96孔板48孔板24孔板12孔板6孔板*EdU培养基100μL150μL200μL500μL1000μL染色反应液100μL150μL200μL500μL1000μL3T3HelaHEK293*细胞系人胚胎细胞酵母细胞人成纤维细胞人宫颈癌细胞人胚肾细胞系细胞周期~30min~3h~18h~21h～25h孵育时间5min20min2h2h2h配制顺序Apollo®染色反应液500μL*1mL5mL10mL1去离子水469μL938μL4.69mL9.38mL2Apollo®反应缓冲液(试剂B)25μL50μL250μL500μL3Apollo®催化剂溶液(试剂C)5μL10μL50μL100μL4Apollo®荧光染料溶液(试剂D)1.5μL3μL15μL30μL5Apollo®缓冲添加剂(试剂E)5mg9mg44mg88mg产品编号荧光染料ExcitationEmissionSimilartoC00051Apollo®488488nm512nmFAMC00031*Apollo®567550nm565nmCy3C00041Apollo®643653nm667nmCy5C00033*Hoechst33342350nm461nmDAPI3/3流式细胞仪检测方法细胞培养每孔1×105~3×106细胞接种于6孔板中，培养至正常生长阶段。药物处理（可选）客户可以根据实验需要进行各种药物处理。EdU标记1.1设置1个不加EdU培养基的对照组，以便进行流式检测数据的染料背景分析。1.2用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液（试剂A），制备适量50μMEdU培养基。注：1）EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（2h）宜采用高浓度（10~50μM），长时间孵育（24h）宜采用低浓度（1~10μM）;2）配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。1.3细胞培养基更换为EdU培养基，每孔加入1mL，孵育2小时。细胞收集2.1将细胞收集至流式管中，1500rpm离心5min，弃上清。注：如贴壁细胞，请先消化收集。2.2用PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清。2.34%多聚甲醛固定15～30min后，2mg/mL甘氨酸中和5min，PBS清洗1次。2.40.5%TritonX-100渗透剂室温孵育10min，PBS清洗1次。Apollo染色3.1每管加入100~500μL的1XApollo®染色反应液（表3），重悬细胞，避光、室温孵育10min后，1500rpm离心5min，弃染色反应液。注：Apollo染色液体积依据细胞量而定，以没过细胞为宜。3.20.5%TritonX-100渗透剂室温清洗1～3次，PBS重悬。其他染色（自备）（可选）客户可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色。注：染料兼容性请参照表4。流式检测及分析1）建议染色完成后立即进行流式检测；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不应超过3天。2）（预实验）取少许细胞进行荧光显微镜观察，以便观察增殖细胞的染色情况，需进行Hoechst复染。如需要，可将预实验结果（包括荧光显微图像及流式检测结果）发至[e-mail]，以便优化实验步骤及分析方法。图1采用50μMEdU标记Hela细胞2h后，采用BDAccuriTMC6流式细胞仪检测Apollo®488通道荧光