段旭昌免疫磁珠分离技术(IMB)及在食品生产中的应用

免疫磁珠分离技术（IMB）及在食品生产中的应用段旭昌副教授西北农林科技大学食品科学与工程学院2013910提纲磁性微球磁性微球结构、分类及特点磁性微球的制备磁性微球分离技术免疫磁株免疫磁珠结构与性质免疫磁株的特点免疫磁珠的分类免疫磁珠的制备免疫磁珠分离技术免疫磁珠技术的应用免疫磁珠在食品安全检测中的应用免疫磁珠与其它检测手段的联用免疫磁珠技术在其他领域的应用免疫磁珠技术的优缺点及发展望一磁性微球•是通过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的复合微球。•高分子磁性微球表面具有众多表面功能基团，同时具有磁响应性，在外加磁场作用下具有磁导向功能。目前已广泛用于生物医学、细胞学和分离工程等领域。二磁性微球结构、分类及特点磁性核材料多为Fe、Co、Pt、Ni等金属及其氧化物。如Fe3O4、γ-Fe2O3、MeFe2O3（Me=Co、Mn、Ni）、BaFe12O19、铁钴合金（Fe-Co和Ni-Fe）。最常用的是Fe、Fe2O3、Fe3O4。其中Fe3O4应用最多。构成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物质。天然高分子有明胶、球蛋白、牛血清白蛋白、聚赖氨酸、淀粉和多种聚糖如纤维素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖、果胶等。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺类、聚苯胺及硅烷等。这些材料可单独用，也可复合使用。磁性微球表面可根据需要赋予不同的功能基团(如－OH、－COOH、－CHO、－NH2,—SH、—CONO2、—CONH2、—SO3H、—SiH3、—环氧基、—CHCl等)，使其表现具有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不同物理性质。同时具有磁响应性，在外磁场作用下具有磁导向性。导电聚合磁微球聚合磁微球对磁性微球的要求：粒径均匀、大小合适、比表面积大、吸附力强、具有强的超顺磁性、悬浮均匀稳定性好、不易聚集沉淀、表面具有多种活性基团、理化性质稳定、具有较好生物相容性、对细胞、机体、活性物质损伤小。由于环氧基、氯甲基功能基团非常活跃，不需连接其他活性基团即可与生物配基（如抗体、抗原等）偶联，及其他基团的微型磁珠在生物学、医学方面应用较为广泛。三磁性微球的制备磁性微球制备方法：共沉淀法、悬浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及原子转移自由基聚合法等。1.共沉淀法金属离子在碱性条件下与高分子共沉淀，一步反应生成磁性高分子微球的方法。2Fe3++Fe2++8OH→Fe3O4+4H2OPich[等先通过单体聚合反应得到PS-AAEM颗粒分散剂，再把配制好的Fe3+、Fe2+溶液加入聚苯乙烯（PS）-乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯（AAEM）颗粒的分散剂中，然后滴加NH3·H2O。Fe3O4粒子在PS-AAEM表面沉积，制得PS-AAEM为核心、Fe3O4粒子为壳层的磁性微球。微球的磁性能通过改变FeCl2和FeCl3的浓度或改变PS-AAEM核心的尺寸来控制。Xia等把一定配比的FeCl2、FeCl3与葡聚糖（dextranT-10）共混，然后滴加NH3·H2O，在超声连续作用下水浴加热，制得以Fe3O4为核、dextran为壳的磁性微球。杨玉东等把一定配比的FeCl3·6H2O、FeCl2·6H2O与配体（如二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）或乙二氨四乙酸（EDTA）等）组成的混合液体加入到75℃的葡聚糖T-10溶液中，并快速滴加NH3·H2O，制备了葡聚糖为壳、氧化铁为核的磁性微球。2聚合法制备磁性微球过程异相聚合法包括分散聚合、乳液聚合、悬浮液聚合三种。该法是将磁性粒子用表面改性剂、偶联剂、引发剂等处理后分散到含有聚合物单体的溶剂中进行聚合反应。通常以磁性粒子为活性中心进行单体聚合。四磁性微球分离技术MACS(MagneticActivatedCellSorting)是将免疫学+细胞生物学+磁力学结合为一体，利用磁性微球表面功能基团的专一亲和特性或多孔吸附特性吸附特定组分，然后用外力磁场作用将吸附了特定物质的磁珠加以分离，再经过洗脱磁珠上吸附的目标物质的一种新型分离技术，具有广泛的用途。几种DNA分离方法的比较ComparationofseveralDNAextractionmethods方法传统法鳌合树脂法玻璃粉法磁珠法免疫亲和法DNA提取酚/氯仿等溶剂抽提Chelex100树脂吸附玻璃粉吸附离心分离磁珠吸附磁场分离抗原抗体反应磁场分离适用范围大多数标本DNA提取纯化培养及各种临床标本土壤标本冰冻、陈旧组织冰冻、陈旧组织，样本含量很少的标本方法评价DNA纯度高、含量多，但较费时，步骤繁琐，用有机溶剂，有损操作者健康。可用于培养标本和各种临床标本细菌及部分病毒核酸的提取。方法简便，可用于土壤中细菌芽孢DNA的提取，不能彻底除去PCR抑制剂。简单、快速，整个过程不到2h，可获得较纯DNA。适于少量样本。DNA纯度高，含量多，适于样本含量少标本，单克隆抗体的制备是关键。五免疫磁珠免疫磁珠（IMB）也称免疫磁性微球，是在磁性微球表面偶联上免疫配基的一种磁性微球，是将磁性微球技术和免疫学相结合的特殊磁性微球。六免疫磁珠的结构与性质免疫磁珠核心为顺磁性粒子，核心外层包裹一层高分子材料，最外层是免疫配基。•免疫配基免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到磁性载体微球上形成免疫磁珠。由于载体微球制备材料和方法不同，其表现出的物理性质也不同，从而可结合不同的免疫配基，如抗原、抗体、凝集素、DNA和RNA等。配基必须具有生物专一性的特点，而且载体微球与配基结合要不影响或改变配基原有的生物学特性，保证磁珠的特殊识别功能。免疫磁珠的性质具有均匀性、超顺磁性及保护性外壳，由磁性载体微球和免疫配基结合而成，表面具有专一亲和性和吸附作用。免疫磁珠大小和形状具有均一性，可使靶物质迅速有效地结合到磁珠上，可使新生成复合物在磁场中具有相同磁响应性，且行为一致。磁珠球形结构可消除与不规则形状粒子间的非特异性结合，顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性，并做定向移动，从磁场移出时磁性消除，磁珠分散，可方便地进行分离和磁性导向。保护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀；免疫配基可专一性结合反应体系中相应的抗原、抗体、核酸等生物活性物质。七免疫磁株的特点•磁性微球与免疫配基结合牢固。•不影响或改变免疫配基原有的生物特性和特异性。•免疫微球的识别专一性。•在磁场中具有顺磁性，离开磁场磁性消失，易于分散。由于聚苯乙烯磁性微球强度高、表面易进行化学维修饰，是比较理性的制造免疫磁珠的材料。八免疫磁珠的分类根据磁珠在磁场中受力大小及磁珠体积，分为小磁珠和大磁珠。•大磁珠：1-5um，粒径较大、悬浮稳定性差、易沉淀、比表面积小、吸附能力低、吸附活性配基少、对细胞影响大，特别是阳性分选时需将磁珠与细胞解离后方可进行下一步实验。但磁力强，无需特殊分离柱即可实现样品分离，分离速度快、过程简单、成本低。•小磁珠：50nm以下，粒径较小、悬浮稳定、比表面积大、表面吸附活性配基多，只有细胞体积的万分之一，对细胞表型和功能影响小，不影响细胞的后续培养。但磁力弱，需特殊分离柱才能实现样品分离，分离速度慢，成本高九免疫磁珠的制备免疫磁珠的制备是将磁性微球和抗体等配基结合而成。磁性微球与抗体的连接方式有共价结合和吸附结合两种方式。共价结合：依靠磁珠表面的活性基团如-CHO、-COOH等与抗体Fab段上的-NH2共价反应和结合吸附结合：依靠磁珠巨大的比表面与抗体见得非特异性吸附而结合。共价结合的牢固度远远大于吸附结合牢固度。制备方法：先制备磁性微球，然后将磁性微球分散于抗体配机溶液中使磁珠与抗体充分吸附结合，然后分离免疫磁珠分散于缓冲溶液中可以使用。十免疫磁珠分离技术免疫磁珠(immunomagneticbead,IMB)分离技术：是一种以特异的抗原抗体反应为基础的免疫学磁性微球检测和分离技术。它是以抗体包被的微球磁珠为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原—抗体复合物，此复合物在外加磁场作用下发生定向移动，从而达到分离抗原的目的。基本原理：磁性微球经过一定处理后,将抗体结合到磁珠上,形成免疫磁性微球（标记磁珠）,标记磁珠的抗体与特异性抗原结合形成抗原—微球复合物,该复合物在磁场中具有与其它组分不同的磁响应性,在磁力作用下,该复合物发生力学移动,从而达到分离抗原的目的。免疫磁珠标记方法1直接磁珠和直接标记法通过物理吸附和共价键结合直接将特意性抗体与磁珠耦合，然后再与相应细胞结合，形成细胞-抗原-抗体-磁珠复合物，在外磁场下直接分离目的细胞。快速、简单、特异性和细胞得率高，灵敏度低，需制备相应的偶联抗体磁珠。2简介磁珠和间接标记法使用anti-lg等与磁珠偶联，通过Anti-lg再使磁珠与二抗体偶联，分离细胞时，先使细胞与一抗特异性结合，然后在与一抗标记磁珠结合，形成细胞-1抗-2抗-anti-lg-磁珠复合体，在外磁场下分离目的细胞的方法。该法增加了细胞的洗涤步骤，特异性也会降低。该法一般用于①没有直标磁珠抗体②需用几种抗体去除多种细胞③目的细胞上特异性抗原分子表达水平低。MACS微珠直标微珠多选微珠间标微珠免疫磁珠分选方法•阳性分选：运用特异性抗体偶联磁珠直接从细胞混合物中分离目的细胞的分选方法称为positiveselection.阳性分选中磁珠标记的细胞即为目的细胞。该法简单、快速、细胞得率和纯度较高。如采用anti-CD14磁珠分选CD14+巨噬细胞。•阴性分选：用抗体偶联磁珠去除无关细胞，使目的细胞得以纯化和分离的分选方法称为negativeselection.阴性分选中磁珠标记的细胞为非目的细胞。如分离CD4+T细胞时，由于没有专用的CD4+T细胞分选磁珠，可通过anti-CD8、anti-B220、anti-CD49b、anti-CD11b、anti-Ter119标记磁珠去除CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、巨噬细胞、粒细胞等，最终而获得较纯的CD4+T细胞。因此阴性分选法适用于：①从细胞混合物中去除某种类型细胞。如肿瘤细胞。②缺乏针对目的细胞筛选的特异性抗体磁珠时。③抗体和目的细胞结合可能诱导细胞活化，影响后续细胞功能分析时。•复合分选：将阴性分选和阳性分选相结合的分选方法。当目的细胞含量特别低，无法直接进行阳性分选时，可采用阴性分选发先出去其他杂细胞，当目的细胞富集到一定程度时在采用阳性分选发筛选目的细胞。免疫磁珠与细胞解离1过夜培养法：常用方法。将结合磁珠细胞置于10%胎牛血清培养基中37℃5%CO2细胞培养箱中培养16-24h，磁珠可从细胞上脱落，再通过磁场除去游离磁珠，即可获得裸细胞。2anti-Fab抗体法：用anti-Fab抗体与磁珠偶联抗体竞争目的细胞，是磁珠与目的细胞解离，用磁场除去游离磁珠，即可获得非标记细胞。3酶解法：通过木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶使磁珠与细胞解离，再通过磁场除去游离磁珠，获得裸细胞。免疫磁珠分离装置免疫磁珠分离装置由超强磁铁分离器和分离柱组成。磁铁和分离柱的型号多样，配合0.5ml、1.5ml微量离心管，15ml及50ml离心管或试管，和96孔或384孔培养板中样品的分离，以满足不同试验要求。十一免疫磁珠分离技术的应用•分离抗原抗体•分离蛋白和多肽•分离多糖物质•分离DNA和RNA•分离细胞和病毒•靶向释药系统的载运•食品有害微生物分析与检测磁珠法分离抗体、抗原、蛋白、多肽、多糖、DNA、RNA操作过程示意图μMACSVitalvirusHiv分离试剂盒分离标记造血细胞表面的Hiv-1病毒CD44H异型细胞免疫磁珠标记细胞示意图免疫磁珠分离细胞及病毒示意图十二免疫磁珠在食品安全检测中的应用免疫磁珠对病毒细胞具有特异选择性，因此能用于食品有害微生物的检测。免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有检测迅速、有选择性分离目的微生物，有效减少背景干扰，提高了精准性。同时还能捕获受损伤靶细菌。目前，免疫磁珠技术已广泛用于食品样品中致病微生物的检测。大肠杆菌O157的检测传统分离E.coliO157∶H7所采用的直接分离法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力