氨基酸强化Torulopsisglabrata发酵生产丙酮

第8卷第6期过程工程学报Vol.8No.62008年12月TheChineseJournalofProcessEngineeringDec.2008收稿日期：2008−05−07，修回日期：2008−07−28基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：30670066,20706025)；国家杰出青年基金资助项目(编号：20625619)；国家重点基础研究发展规划(973)基金资助项目(编号：2007CB71403)；国家高技术研究发展计划(863)基金资助项目(编号：2006AA02Z201)作者简介：许庆龙(1983−)，男，湖北省十堰市人，硕士研究生，发酵工程专业；刘立明，通讯联系人，E-mail:[e-mail].氨基酸强化Torulopsisglabrata发酵生产丙酮酸许庆龙，许晓鹏，刘立明，史仲平，堵国成，陈坚(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)摘要：在维生素限量添加的条件下，研究了添加氨基酸对丙酮酸发酵的影响.在发酵初始添加0.8g/L谷氨酸、0.6g/L酪氨酸和0.2g/L甲硫氨酸使丙酮酸产量分别提高23.5%,16.4%和11.8%.动力学分析表明，添加以上3种原料提高丙酮酸生产性能的原因在于用于细胞生长的葡萄糖下降，显著提高了细胞对葡萄糖的产率系数(Yx/s)和丙酮酸对葡萄糖的产率系数(Yp/s).添加氨基酸导致胞内NADH/NAD+比下降，增加了胞内NAD+可用度，加强了糖酵解速度，从而提高了丙酮酸生产强度.关键词：光滑球拟酵母；氨基酸；丙酮酸；发酵中图分类号：TQ921文献标识码：A文章编号：1009−606X(2008)06−1200−041前言在利用光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)多重维生素营养缺陷型菌株CCTCCM202019发酵生产丙酮酸的过程中，培养基中亚适量的维生素导致由丙酮酸节点进入氨基酸代谢及三羧酸循环(TCA循环)的碳流量减少，最终使细胞生长受到抑制而代谢活性减弱(图1)[1].为此考虑在维生素限量时保证一定丙酮酸浓度的情况下，添加氨基酸或TCA循环的中间代谢产物促进细胞生长，以期提高丙酮酸生产强度.已有研究[2−4]表明，添加一定的外源氨基酸和TCA循环中间产物能维持细胞生长和代谢产物的合成.另一方面，提高丙酮酸生产强度的最适条件是胞内NADH含量较低[5]，在培养基中添加一定浓度的氨基酸能减少细胞合成氨基酸而产生的大量NADH，从而降低胞内NADH含量[6].从这一思路出发，本工作在维生素限量的条件下，研究了氨基酸对T.glabrata细胞生长、NADH代谢和丙酮酸生产强度的影响.2材料与方法2.1菌种光滑球拟酵母T.glabrataCCTCCM202019,NA,Bio,B1,B6四种维生素营养缺陷型，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，为本研究室选育[5].2.2培养基斜面和种子培养基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨10，KH2PO41,MgSO4·7H2O1,琼脂20(斜面添加)，pH5.5.发酵培养基：参见文献[5].GlucosePYREthanolNADNADHAminoacidsAcetyl-CoAB1ⅠⅡⅢⅣNAB6B1NABioCitrateOxaloacetateTCAcycleI.PyruvatedecarboxylaseII.TransaminaseIII.PyruvatecarboxylaseIV.Pyruvatedehydrogenasecomplex图1T.glabrataCCTCCM202019中丙酮酸的代谢途径[1]Fig.1MetabolismpathwayofpyruvateinT.glabrataCCTCCM202019[1]2.3培养方法和分析方法参见文献[5].3结果与讨论3.1常见氨基酸对丙酮酸发酵的影响1g/L各种氨基酸对T.glabrata发酵生产丙酮酸的影响如表1所示.依据丙酮酸产量提高的程度，将各种氨基酸的作用分为以下3类：(1)谷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸能显著提高丙酮酸的产量(10%)和葡萄糖产率；(2)天冬氨酸和天冬酰胺能使丙酮酸产量提高5%∼10%；(3)丝氨酸、色氨酸、胱氨酸和组氨酸则对丙酮酸合成没有明显的促进作用，甚至对细胞生长和丙第6期许庆龙等：氨基酸强化Torulopsisglabrata发酵生产丙酮酸1201酮酸的合成表现出一定的抑制作用.表1常见氨基酸对T.glabrata发酵生产丙酮酸的影响Table1EffectofaminoacidsonthecellgrowthandpyruvateproductionbyT.glabrataAminoacidDryweightofcell(g/L)Pyruvate(g/L)Control10.440.1Methionine12.547.2Proline11.240.2Cysteine9.029.4Glyceine10.131.4Glutamicacid12.145.4Tyrosine12.146.6Arginine11.339.9Serine11.435.2Lysine10.940.1Asparticacid12.940.6Histidine9.032.6Phenylalanine9.640.2Glutamine10.941.3Leucine9.435.6Alanine11.937.4Threonine8.631.7Asparagine11.744.6Isoleucine10.739.9Valine10.640.8Tryptophan12.635.53.2氨基酸添加时间对丙酮酸合成的影响谷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸的添加时间对丙酮酸发酵的影响如图2所示.添加时间分别为发酵初始(0h)、对数生长期早期(13h)、对数生长期晚期(26h)、稳定期(39h)和发酵结束(52h).由图2可知，在发酵初始时添加1g/L谷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸使丙酮酸产量分别提高17.5%,12.6%和11.3%.3.3氨基酸浓度对丙酮酸发酵的影响发酵初始时谷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸添加浓度对丙酮酸发酵的影响如图3(a)∼3(c)所示.在一定氨基酸浓度范围内(0∼1g/L)，细胞浓度和丙酮酸产量随着氨基酸添加浓度的增加而不断提高；而继续提高氨基酸的浓度(≥1g/L)，细胞浓度和丙酮酸产量则不断降低；当氨基酸浓度大于4g/L时，细胞生长和丙酮酸的合成则受到一定程度的抑制.在0∼1g/L范围内，培养基中谷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸浓度对细胞生长和丙酮酸的影响如图3(d)∼3(f)所示，其相应的最佳浓度为0.8,0.6和0.2g/L.图2氨基酸添加时机对细胞生长和丙酮酸合成的影响Fig.2Effectofaddingtimeofglutamicacid,tyrosineandmethionineonpyruvatefermentation3.4适宜条件下添加外源氨基酸的丙酮酸发酵过程在最佳添加时间和最适添加浓度下，谷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸对T.glabrata丙酮酸生产过程的影响如图4，相关发酵参数列于表2.图4表明，添加谷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸明显促进了细胞生长[图4(a)]和葡萄糖消耗[图4(b)].发酵60h时丙酮酸产量比对照分别提高了23.5%,16.4%和11.8%[图4(c)].表明添加谷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸实现了促进细胞生长、加速葡萄糖消耗并提高丙酮酸产量.添加谷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸使用于细胞生长的葡萄糖下降，因此细胞对葡萄糖产率系数(Yx/s)和丙酮酸对葡萄糖产率系数(Yp/s)显著提高(表2).3.5添加外源氨基酸促进丙酮酸发酵的机理T.glabrata并不能以氨基酸为唯一氮源进行生长.添加氨基酸促进丙酮酸积累的原因是，丙酮酸进入氨基酸代谢库的流量由培养基中维生素B6调控，在培养基中亚适量的维生素B6浓度(0.4mg/L)下，细胞生长较微弱，这是因为亚适量的维生素B6使丙酮酸转氨酶活性下降导致氨基酸合成受阻，但有效地提高了丙酮酸对葡萄糖的得率.将维生素B6浓度提高到1mg/L，发现细胞浓度增加11.8%，而丙酮酸产量下降了26.3%(图5).这是因为随着培养基中B6浓度的增加，丙酮酸转氨途径被激活[7]，导致丙酮酸节点导向氨基酸合成的碳流明显增大，细胞生长速度加快，而丙酮酸产量和产率明显下降[8,9].在培养基中添加一定浓度的氨基酸既促进了细胞生长，又提高了丙酮酸对葡萄糖的产率系数(Yp/s)(如表2).Control0132639521012141637.540.042.545.047.550.0(c)MethionineTime(h)Control0132639521012141637.540.042.545.047.550.0Dryweightofcell(g/L)Time(h)(a)GlutamicacidPyruvate(g/L)Control0132639521012141637.540.042.545.047.550.0(b)TyrosineTime(h)1202过程工程学报第8卷图3氨基酸添加浓度对细胞生长和丙酮酸合成的影响Fig.3Effectofaddedconcentrationofaminoacidsonpyruvatefermentation图4添加氨基酸对细胞生长和丙酮酸合成过程的影响Fig.4Effectofaminoacidsadditiononcellgrowth,glucoseconsumptionandpyruvateproduction表2外源添加氨基酸对Yx/s和Yp/s的影响Table2Effectofaminoacidsadditionontheyieldofcellonglucose(Yx/s)andyieldofpyruvateonglucose(Yp/s)ParameterControlGlutamicacidTyrosineMethionineYx/s0.130.150.140.15Yp/s0.360.480.490.46添加谷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸一定程度降低了胞内NADH/NAD+比(图6)，原因在于添加外源氨基酸弱化了细胞合成氨基酸的功能[10,11]，从而降低胞内NADH/NAD+水平，强化丙酮酸合成效率(图4).这与S.cerevisiae添加谷氨酸或氨基酸混合液厌氧发酵，细胞可直接吸收外源游离氨基酸满足蛋白质等物质的生物合成、导致胞内NADH水平很低的结果[6]相似.图5维生素B6对细胞生长和丙酮酸合成的影响Fig.5EffectofvitaminB6oncellgrowthandpyruvatefermentation0246810101112131415161735.037.540.042.545.047.550.0(a)Drywightofcell(g/L)Glutamicacid(g/L)Pyruvate(g/L)0246810101112131415161735.037.540.042.545.047.550.0(b)Tyrosine(g/L)0246810101112131415161732.535.037.540.042.545.047.550.0(c)Methionine(g/L)0.00.20.40.60.81.013141516171837.540.042.545.047.550.052.5(d)Dryweightofcell(g/L)Glutamicacid(g/L)Pyruvate(g/L)0.00.20.40.60.81.013141516171837.540.042.545.047.550.052.5(f)Methionine(g/L))012243648600246810121416(a)GlutamicacidGlucoseonlyTyrosineMethionineDryweightofcell(g/L)Time(h)01224364860020406080100120GlutamicacidGlucoseo