甜高粱茎秆固态发酵生产燃料乙醇研究

甜高粱茎秆固态发酵生产燃料乙醇研究康利平，刘莉，刘萍，孙君社＊中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京(100083）[e-mail]摘要：本文通过研究甜高粱茎秆M-81E固态发酵生产燃料乙醇的主要影响因素，确定最优发酵条件为：耐高温酿酒酵母接种量为3％，发酵初始基质水分含量为76%，添加0.25％CaCl2，0.25％MgSO4·7H2O，40℃发酵24h，乙醇得率为6.42g/100g甜高粱茎秆，转化率为90.5%，残糖含量低于0.3%；添加10FPU/g纤维素酶和10CBU/gβ-葡萄糖苷酶，进行同步糖化固态发酵，乙醇得率为7.53g/100g甜高粱茎秆，与不添加纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的相比，乙醇得率提高了14.6%。关键词：甜高粱茎秆；固态发酵；燃料乙醇中图分类号：S216.21引言甜高粱（SorghumbicolorMoench.L.），又称糖高粱、芦粟或甜秆，既是一种粮食作物、糖料作物，又是能源作物。每亩甜高粱产4000~5000Kg富含糖分和纤维的茎秆，200~500Kg的粮食籽粒[1]，其中70-80%的干重组分可被利用生产燃料乙醇[2]。随着国家对粮食燃料乙醇的限制，发展甜高粱燃料乙醇是发展清洁生物能源的重要要途径。固态发酵具有能耗小，产物浓度高，产生废水少，运作费用低等优点[3]。而目前国内外对甜高粱固态发酵生产燃料乙醇的研究仍比较少，Mamma[4]等人利用Fusariumoxysporum和Saccharomycescerevisiae混菌糖化发酵甜高粱茎秆，利用Fusariumoxysporum产酶水解纤维素和半纤维素等不可溶性糖，其发酵周期较长；Bryan[5]对未灭菌甜高粱茎秆进行自然固态发酵，副产物较多；宋俊萍[6]等对甜高粱茎秆直接粉碎固态发酵条件进行了研究。本文通过对甜高粱茎秆M-81E粉碎后固态发酵条件进行摸索的同时，还探索了纤维素酶对甜高粱茎秆固态发酵的作用，充分利用甜高粱茎秆中的可溶性糖和部分纤维素发酵生产燃料乙醇，提高乙醇得率。2材料与方法2.1实验材料甜高粱茎秆：品种M-81E，产地滨州，由山东滨州光华生物能源有限公司提供，2006年5月种植，10月收割，生长期为150天。新鲜甜高粱茎秆中水分含量72.80%，总糖含量13.92%，粗纤维含量9.61%。耐高温酿酒酵母：中国农业大学发酵工程实验室保存菌种。纤维素酶：湖南尤特尔生化有限公司提供。其中滤纸酶活200FPU/g，β-葡萄糖苷酶酶活69CBU/g。Novozym188：Sigma公司购买，其中β-葡萄糖苷酶酶活301CBU/L。斜面保藏培养基：2%葡萄糖，1%酵母膏，2%蛋白胨，0.2%KH2PO4，0.1%MgSO4·7H2O，自然pH值，121℃，灭菌15min。种子活化培养基：2%葡萄糖，1%酵母膏，2%蛋白胨,自然pH值，121℃，灭菌15min。-1-。于121℃，灭菌15min。接入培养18h的种子培养基，根据发酵条件进行调节，塞上发酵栓，静止发酵。实验设置两个重复。2.2.2水分含量测定将粉碎后甜高粱茎秆于60℃烘箱中风干至恒重。根据质量差值计算得出水分含量。2.2.3甜高粱茎秆糖分测定粉碎后甜高粱茎秆用75％乙醇，150w超声波50℃分次浸提40min，过滤定容。还原糖测定：DNS法[7]。总糖测定：浸提滤液用1.2NHCl于60℃水解7min，用1NNaOH中和至中性，DNS法[7]测定。2.2.4粗纤维测定[8]2.2.5乙醇含量测定：将发酵后醪糟，用大约100ml的蒸馏水多次洗涤倒入250ml的蒸馏烧瓶中，蒸馏，用50ml的容量瓶收集馏分，当馏分接近50ml时，停止蒸馏，用蒸馏水定容。气相色谱条件：PerkinElmerAutosystemxl，色谱柱：DikmaCapCapillaryColumns（30m×0.53μm），进样量1μl，进样口温度200℃，检测器温度230℃。2.2.6发酵残糖含量测定：DNS法[7]2.2.7CO2失重测定：重量法[9]3结果与分析3.1接种量对甜高粱茎秆固态发酵的影响酵母菌在种子培养基中活化培养18h后，按甜高粱茎秆质量的1％，3％，5％，8％，10％，12％接入菌悬液，进行发酵。从图1可以得出，接种量为3％时，乙醇产率最高，100g甜高粱茎秆能够生成6.14g乙醇，此时发酵基质中残糖含量也相对比较低，小于0.4％。而接种量过低或者过高，都不利于乙醇的生成。可能当接种量较少时，酵母利用过多的营养物质进行组织分裂和生长，没有进入乙醇发酵途径；当接种量过大时，发酵空间及养分都不能满足酵母需要，影响最终乙醇产率。-2-接种量乙醇g/100g甜高梁茎秆0.00%0.10%0.20%0.30%0.40%0.50%0.60%残糖含量乙醇残糖含量图1接种量对甜高粱茎秆固态发酵的影响Fig1.InfluenceofDifferentInoculationonSolidFermentationofSweetSorghumStalks3.2基质水分含量对甜高粱茎秆固态发酵的影响甜高粱茎秆在放置贮藏过程中，极易失水[10]，而基质水分含量是固态发酵过程中一个重要的因素，影响着酵母的生长代谢、传质导热，因此发酵过程中需要对基质进行水分调节。试验中调节甜高粱茎秆水分含量至70%，72%，74%，76%，78%，80%,接种3%，36℃进行发酵。20.0%40.0%60.0%80.0%100.0%70%72%74%76%78%80%固态发酵基质水分含量乙醇转化率0.00%0.20%0.40%0.60%0.80%1.00%残糖含量乙醇转化率残糖含量图2初始基质水分含量对甜高粱茎秆固态发酵的影响Fig2.InfluenceofOriginalWaterContentonSolidFermentationofSweetSorghumStalks从图2可以看出，随着基质含水量的增加，乙醇产率呈上升趋势，最后达到稳定状态。当发酵基质中水分含量低于74％时，乙醇产率受到较大影响，主要原因是发酵前期，酵母繁殖生长需大量水分，当含水量低时，其呼吸、传热等过程受到抑制；而发酵中后期，乙醇生成同时产生的水，能够满足酵母发酵过程所需水分，和部分水分蒸发，因此只要考虑发酵过程的起始水分含量即可。从保护环境和节约成本的角度出发，选择基质水分含量在76％左右进行固态发酵比较合适。3.3无机盐对甜高粱茎秆固态发酵的影响CaCl2·和MgSO4·被认为对微生物的生长和发酵影响较大[11]，钙离子是一些酶的稳定剂和激活剂(如蛋白酶等)，它还能与果胶等杂质的作用，减小杂质对发酵过程的抑制；镁离子-3-参与酵母代谢过程中许多反应，并且提供酵母中含硫氨基酸的成分。本文研究了CaCl2·及MgSO4·7H2O对甜高粱茎秆固态发酵的影响，如图3，图4所示，当CaCl2和MgSO4·7H2O的添加浓度都为0.25％，乙醇转化率最高，然而无机盐添加浓度过高时，发酵基质渗透压过高，不利于酵母的生长和发酵，使得乙醇转化率下降。20.0%40.0%60.0%80.0%100.0%CK0.25%0.50%1.00%1.50%CaCl2添加量乙醇转化率0.00%0.10%0.20%0.30%0.40%0.50%残糖含量乙醇转化率残糖含量图3CaCl2·对甜高粱茎秆固态发酵的影响Fig3.InfluenceofCaCl2onSolidFermentationofSweetSorghumStalks20.0%40.0%60.0%80.0%100.0%CK0.25%0.50%1.00%1.50%MgSO4.7H2O添加量乙醇转化率0.00%0.20%0.40%0.60%0.80%残糖含量乙醇转化率残糖含量图4MgSO4·对甜高粱茎秆固态发酵的影响Fig4.InfluenceofMgSO4·onSolidFermentationofSweetSorghumStalks3.4发酵温度对甜高粱茎秆固态发酵的影响本文研究温度对甜高粱茎秆固态发酵的同时，还研究了纤维素酶对固态发酵的作用效果。比较了添加酶（10FPU/g纤维素酶和10CBU/gβ-葡萄糖苷酶，以甜高粱茎秆干重计算）与不添加酶在各温度下固态发酵生产乙醇的情况，从表1可以看出，40℃发酵时乙醇得率均达到最高，温度过低或过高都不利于乙醇生成，此时，添加纤维素酶发酵的乙醇得率可达到7.53g/100g甜高粱茎秆，比不添加酶提高了14.8%。各温度下加酶发酵的乙醇得率均高于未加酶发酵，这是因为在乙醇发酵的同时，纤维素酶对甜高粱茎秆中大量存在的纤维素进行糖化分解，从而生成了乙醇。而甜高粱茎秆中粗纤维含量约10%，与可溶性糖含量相差-4-不大，可加酶同步糖化固态发酵过程中乙醇得率提高量不超过15%，说明发酵过程中纤维素的利用率非常低，原因还在于甜高粱茎秆纤维素没有经过预处理，结构紧凑，空间间隙小[12]，纤维素酶与之接触面积少，加上甜高粱茎秆本身含糖量高，底物反馈抑制使纤维素酶水解效率低。添加纤维素酶进行固态发酵的残糖含量比不添加酶要高，前者残糖含量0.6％左右，后者在0.3％以下。这可能是酵母菌优先利用葡萄糖而使半纤维素分解产生的木糖过剩造成，也可能是可溶性糖发酵完全后，纤维素酶继续分解甜高粱茎秆的木质纤维素，产生还原糖，而使得残糖含量较高。表1发酵温度对甜高粱茎秆固态发酵的影响Table1.TemperaturesInfluenceonSolidFermentationofSweetSorghumStalks添加纤维素酶未添加纤维素酶发酵温度乙醇得率(g/100g茎秆)残糖含量(%)乙醇得率(g/100g茎秆)残糖含量(%)28℃6.580.575.880.2132℃6.980.576.050.2036℃7.180.556.220.2340℃7.530.546.420.2244℃6.430.745.860.303.5甜高粱茎秆固态发酵发酵时间的确定根据酵母发酵途径，其反应方程式为C6H12O6→2C2H5OH+2CO2↑,由该式可知，CO2释放量：乙醇=22：23，可以根据CO2的失重确定乙醇的发酵程度。甜高粱茎秆发酵过程中，每隔两小时称取发酵瓶重，得CO2失重的曲线（图5），甜高粱固态发酵的发酵时间主要集中在第6-16小时，其中第10小时达到发酵的高峰，其中添加纤维素酶的失重比没有添加纤维素酶的要大。20h后CO2失重不明显，但添加纤维素酶的发酵瓶中CO2失重仍缓慢进行，说明酵母仍在利用甜高粱茎秆中的木质纤维素进行同步固态发酵，综合发酵时间和乙醇转化率，发酵以20-24h合适。0.000.501.001.502.002.500481216202428发酵时间/hCO2失重g/两小时未添加纤维素酶添加纤维素酶图5甜高粱茎秆固态发酵过程中CO2的失重Fig5.CO2EmissioninSweetSorghumStalksbySolidFermentation4结论4.1通过研究甜高粱茎秆固态发酵生产燃料乙醇，得最优发酵条件为：酿酒酵母接种量为-5-％，发酵基质初始水分含量为76％左右，发酵温度40℃，添加0.25％CaCl2，0.25％MgSO4·7H2O，发酵时间为24小时，乙醇得率为6.42g/100g甜高粱茎秆，转化率为90.5%，残糖含量为0.3％以下。4.2在4.1最优发酵条件下添加10FPU/g纤维素酶和10CBU/gβ-葡萄糖苷酶，进行甜高粱茎秆同步糖化固态发酵，乙醇得率为7.53g/100g甜高粱茎秆，与不加纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的相