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生产中常用菌种的分离、选育和保藏主讲人：韩北忠刘萍带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置第一节菌种的分离简介一、菌种的来源•根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；•从大自然中分离筛选新的微生物菌种。二、分离思路•新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。•实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。•有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。•定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。•采样：有针对性地采集样品。•增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。•分离：利用分离技术得到纯种。•发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤（一）采样1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。从自然界筛选•2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。•3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。（二）增殖培养•为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。•例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。（三）培养分离•尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。（四）筛选•这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。（五）毒性试验•自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。第二节培养分离•从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。•到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。•在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。•因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的。一、成功的分离培养方法(1)认真考它所需产品的特征和生产过程；(2)制订初步的筛选标准；(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。二、培养分离中要解决的问题1、“分离什么和从哪里分离出?”2、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性及遗传操作的难易程度等。3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。三、将生态学方法用于培养分离的一般思路要点•1．罗列出所要分离的微生物类群；•2．根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地：•3．将若干样本分成若干类型，如植物和植物各部，土壤(类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等；•4．罗列出所要考察和测量的环境参数，如pH、盐分、水分、氧化还原电势及温度等；5．列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；6．根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件；7．用标准方法作对照来评价生态学分离方法；8．根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；9．运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。四、自然界中细菌的分离(一)采样和采集方法•为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。•样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；•5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长1．土样采集方法•森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；•水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。•在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。2．植物体采集方法•在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。•选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。•采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。3．水样采集方法•用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。•由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。•方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。(二)生态学参数及培养基的组成原则1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50μg／m1，以抑制真菌的生长。4、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l、2天。5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。土中细菌的富集培养与分离•分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。•但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。富集方法•运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。•富集可以促进抗性的产生并维持下来。•土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。•植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。•水中细菌的分离：水样通过0.22μm无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。水中细菌分离的简易富集技术•在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；•在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。•培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。•另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。•通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。次代培养及纯化步骤1、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。2、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板上进行筛选。五、放线菌的分离•(一)采样及采集方法•应尽可能实行无菌操作。•所采集的样本应具有一定的代表性。•样本采集完后，应及时处理或在4℃下贮存，贮存试样处应与划线，筛选平板分开，贮存时间不宜过长。(二)生态学参数•放线菌分离培养过程中所需考虑的生态参数有温度、pH、离子强度、氧化还原电势和底物浓度。（三）培养基的组成原则•大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。•在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。•选择性地添加抗生素。•分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37℃培养箱中存放3天。放线菌的分离•土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。•植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。•水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。次代培养及纯化•菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。•通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。•成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。•将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离。六、真菌分离1、利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。真菌的分离方法•土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。•植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。•水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱技术常用于水中真菌的富集。•子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。七、生产选种•是在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表