基因治疗(6)

1.药物治疗2.手术治疗3.放射治疗4.理疗传统治疗方法•新的生物治疗：•基因治疗(genetherapy)基因治疗一、概念二、策略三、基本流程四、应用与展望一、基因治疗的概念•Genetherapyisamedicalinterventionbasedonmodificationofgeneticmaterialsinlivingcells.•基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的生物医学治疗。概念的发展•经典概念：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。•广义概念：将某种遗传物质转移至患者细胞内，使其在体内有效表达，最终达到治疗疾病目的的方法，均称之为基因治疗。二、基因治疗的策略(一)直接策略：•针对致病基因(二)间接策略：•导入与致病基因无直接联系的治疗基因(一)直接策略1.基因矫正（genecorrection）2.基因置换（genereplacement）3.基因增补（geneaugmentation）又称为补偿性基因治疗4.基因干预（geneinterference）又称为反义基因治疗1.基因矫正（genecorrection）指将致病基因的突变碱基加以纠正，而保留正常部分。2.基因置换（genereplacement）指通过同源重组（基因打靶）技术，将正常基因定点整合到靶细胞基因组内，以原位替换致病基因。不涉及基因组整体改变的情况下对缺陷基因进行精确的原位修复，是最理想的治疗方式。基因打靶技术指目的基因导入靶细胞后，通过目的基因与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的交换，将目的基因定点整合到靶细胞基因组上某一确定位点的技术。3.基因增补（geneaugmentation）成熟的策略•是指不去除异常基因，将有功能的正常基因导入病变细胞或其它细胞后发生非定点整合，表达正常产物以补偿缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加强。4.基因干预（geneinterference）是采用特定的方法，导入外源基因选择性地阻断、干扰、抑制和封闭有害基因在DNA、RNA和蛋白质水平的表达及其生物合成。•导入抑癌基因•反义核酸技术(antisensetechnology)：①反义RNA；②反基因技术；③核酶•RNA干扰（RNAinterference)抑癌基因疗法抑癌基因：是正常细胞内正常存在的，能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因p53基因治疗研究：（1）野生型p53基因的替代疗法（2）突变型p53基因的阻断疗法（3）与p53基因有关的新型肿瘤疫苗反义核酸1.反义RNA（antisenseRNA）：与mRNA互补的RNA，抑制mRNA的加工与翻译。2.核酶（ribozyme）：具有催化功能的RNA，其与相应mRNA结合后能发挥酶活性，将mRNA降解。3.反义脱氧寡核苷酸，ODN反义RNA技术•体外合成反义RNA，直接导入；•将特异的反义基因通过特定的表达载体（质粒、病毒）导入细胞，转录出反义RNA发挥作用，避免了在给药途径中易被RNase降解的缺点。关键性问题1.专一性转移如何专一的作用于病变细胞，而不影响其他正常细胞。2.反义RNA进入靶细胞前的降解问题解决：•特定受体介导的反义RNA转移受体介导的反义RNA转移脱唾液酸糖蛋白（ASGP）受体介导的转移，通过化学物质作为中间连接物，将ASGP与多聚赖氨酸（PL）共价结合，得到ASGP-PL复合物，这种复合物可以携带RNA，再专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并被吞噬到肝细胞内发挥作用。反义RNA应用前景1.安全性高不改变基因结构，最终在细胞内被降解。2.设计和制备方便体外转录获得。3.具有剂量调节效应4.能直接作用于一些RNA病毒反基因技术•脱氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucleotide,ODN），也被称为TFO(triplehelix-formingoligo)•通过TFO在DNA结合蛋白的识别位点处，与靶基因结合形成三螺旋，从而位点专一性地干扰DNA与反式作用因子的结合，抑制转录起始或转录延伸，达到“反基因”的目的。•DNA水平阻止基因转录•肽核酸（peptidenucleicacids，PNA，一种以多肽骨架取代糖-磷酸骨架的DNA类似物）核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognitionsequences“hammerhead”ribozymes1981年，Cetch和Alfman首次发现了一类具有特异性剪切RNA活性的RNA分子。•核酶具有稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。•核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合并切割其他的mRNA，效率高于反义RNA。核酶的特点RNA干扰技术概念：短的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使同源mRNA发生特异性的降解，从而阻断相应基因的表达。高度的序列专一性高效性易操作性miRNA•MicroRNA（miRNA）是内源性的，是一种非编码的RNA；由miRNA基因表达出最初的pri-miRNA分子。•靶标mRNA通常发生不完全结合，并且结合的位点是mRNA的非编码区的3’端；它不会降解靶标mRNA，而只是阻止mRNA的翻译。•miRNA能够调节与生长发育有关的基因。•在生物体中的表达具有时序性、保守性和组织特异性(二)间接策略导入与致病基因无直接联系的治疗基因1.免疫基因治疗2.分子化疗3.特异性细胞杀伤1.免疫基因治疗(1)细胞因子基因治疗IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF(2)免疫增强基因疗法MHCI类抗原、共刺激分子(3)肿瘤DNA疫苗疗法癌胚抗原（CEA）制备的肿瘤DNA疫苗TumourNecrosisFactor2.分子化疗(1)自杀基因疗法：TK基因、CD基因(2)化疗保护性基因治疗：MDR基因(3)药物增敏基因治疗：钙调素基因(1)自杀基因疗法•自杀基因（suicidegene)，前体药物酶转化基因•该基因表达产生的酶可催化无毒性的药物前体转变为细胞毒性物质，从而杀死肿瘤细胞；•同时通过“旁观者效应”（bystandereffect）杀死邻近未导入该基因的分裂细胞而显著扩大杀伤效应。•由于携带该基因的受体细胞本身也被杀死，所以这类基因被称为“自杀基因”。自杀基因•单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因编码胸苷激酶（TK）催化丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）成为磷酸化的核苷酸类似物，阻断DNA的合成而使细胞死亡。•大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因将5’-氟胞嘧啶（5’-FC）转化为5’-氟尿嘧啶（5’-FU）而发挥细胞毒性作用。viralvector（HSV）TargetedKilling-GeneticPro-drugActivationTherapytumourcellthymidinekinasegeneganciclovirphosphateGanciclovir（GCV）tkGanciclovirphosphateinhibitsDNApolymeraseCelldeath–Includingbystandercells(2)化疗保护性基因治疗•指将编码抗细胞毒性药物蛋白的基因导入人体细胞，以提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力。•如将多药抗性（multipledrugresistance,MDR）基因MDR-1导入骨髓造血干细胞，减少骨髓受抑制的程度，以加大化疗剂量，提高化疗效果。(3)药物增敏基因治疗•将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对药物的敏感性。•如将钙调素基因转入癌细胞，其表达产物作为细胞内信号转导系统的重要物质，明显增强肿瘤细胞对化疗药物的吸收量而相应减少了排出量，使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。3.特异性细胞杀伤•指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特异性杀伤该肿瘤细胞。特异性细胞杀伤•如将绿脓杆菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基因与TGFα基因组成融合基因TGFα-PE，或TGFα-DT。•由于TGFα与表皮生长因子EGF结构类似，也能与表皮生长因子受体（EGFR）结合；•故该融合基因可特异性进入并杀死高度表达EGFR的膀胱癌、肾癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞。三、基因治疗的基本流程（一）外源基因的选择与制备（二）载体的选择与构建（三）靶细胞的选择（四）基因转移（五）基因转染细胞的筛选与鉴定（六）回输体内基因治疗的方式根据基因导入的方式分为两种：1.直接体内疗法（invivo）是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。2.间接体内疗法（exvivo）是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。基因治疗的种类•生殖细胞基因治疗•可遗传性•伦理学问题•禁止应用人体•体细胞基因治疗：研究重点体细胞治疗的概念•指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）的体细胞；•经体外操作后。•回输（或植入）人体的治疗方法。（一）外源基因的选择与制备•外源基因目的基因：与致病基因相对应的有功能的正常基因与致病基因无关、有治疗作用的基因标记基因:新霉素磷酸转移酶（Neo）基因•外源基因的获得基因克隆人工合成PCR扩增外源基因的选择原则1.体内少量表达就可显著改善症状；2.过高表达不会对机体造成危害；3.在抗病毒和病原体的基因治疗中，所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中起重要的作用，并且该序列是特异的；4.肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因转入人体；可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因或向细胞内转入野生型抑癌基因，抑制肿瘤生长，所针对的癌基因或抑癌基因应与该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。（二）载体的选择与构建病毒载体：•逆转录病毒（RV)•腺病毒（AV)•腺相关病毒（AAV)•单纯疱疹病毒（HSV)•痘苗病毒（VV)非病毒载体：•脂质体法•直接注射法•受体介导基因转移•DNA-磷酸钙共沉淀•电穿孔逆转录病毒结构逆转录病毒的基因组结构3’LTR5’LTRgagpolenv结构基因gag(groupantigen)：编码核心蛋白和属特异性抗原pol(polymerase)：编码逆转录酶env(envelop)：编码病毒外壳蛋白和包膜蛋白LTR（longterminalrepeat）序列含增强子、启动子、转录所需起始和终止信号逆转录病毒的生活史逆转录病毒宿主细胞病毒RNAcDNA前病毒病毒RNA包装蛋白包装成完整的病毒颗粒出芽分泌子代病毒感染其他细胞整合病毒载体构建（1）去除病毒致病性结构的基因序列如逆转录病毒的gag、pol、env基因，从结构上保证病毒的安全性。同时产生的空白区以目的基因取而代之；（2）保留其基因的调控序列及包装序列等；（3）插入标记基因如Neo基因以对基因转染细胞的抗性筛选等。包装细胞•指将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成的一种特殊的细胞系.这种细胞因携带有完整的病毒结构基因序列能够大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（ψ序列）而不能包装,不产生有复制能力的野生型病毒颗粒。假病毒颗粒•当逆转录病毒载体转染进包装细胞后，转录出标记基因和目的基因的RNA，含有两端的LTR和包装信号，被包装细胞产生的病毒蛋白包装成病毒颗粒。•因包装的RNA中不含病毒蛋白的编码序列，导致这种病毒只有一次感染能力，即在感染细胞后，不能产生新的病毒颗粒，称为假病毒颗粒。•假病毒颗粒释放到包装细胞的培养液中，用于感染靶细胞，从而将其携带的治疗基因送入靶细胞。VectorDNAHelperDNAEngineeringaVirusintoaVectorwildtypevirusViralvectorreplicationproteinsstructuralproteinsPackagingTherapeuticgeneessentialviralgen