生产菌种的来源

《课程安排》微生物工程概论生物菌种的来源优良菌种选育菌种保藏的原理与方法培养基微生物的代谢调控和代谢工程《微生物工程的概念》微生物工程菌株选拔生产工艺野生菌株工程菌株半成品基因工程细胞工程发酵工程酶工程生物反应器工程提纯技术下游处理产品《要点》1生物物质产生菌的筛选微生物是生物活性物质的丰富资源标本采集标本预处理2菌株的分离施加选择压力的分离法随机分离法生产菌种的来源《生物物质产生菌的筛选》菌种筛选流程（一般需要改变）标本采集预处理富集培养菌种初筛菌种复筛性能鉴定菌种保藏IsolationEnrichment1.微生物是生物活性物质的丰富资源微生物种类多，分布广，适应能力强，在极端环境中进化了合成特殊功能的物质采样地点？采样方法？目的产物的性质产生菌分布，特性，生态环境高选择性筛选法2.标本采集土壤的菌种资源最丰富，不同土壤含微生物菌种不同菜园农田：细菌，放线菌果园：酵母动植物残骸：霉菌豆科植物根系：根瘤菌油田：石油降解菌被污染土壤：污染物降解菌白蚂蚁肠道：木材成分降解菌海洋：海洋细菌（3.5%盐），1atm/10m，嗜压菌温泉：嗜热菌雪山，冰河：嗜冷菌盐湖：嗜盐菌（10%以上）《菌种筛选主要步骤》调查研究及查阅充分的资料↓设计实验方案↓确定采集样品的生态环境采样↓确定特定的培养条件增殖培养↓确定特殊的选择培养基及定性快速检测法平板分离↓保存↓发酵实验↓确定发酵培养基础条件筛选↓初筛（1株1瓶）↓复筛（1株3～5瓶）↓结合初步工艺条件摸索再复筛（1株3～5瓶）↓3～5株↓生产性能试验↓毒性试验↓菌种鉴定•采样季节：以温度适中，雨量不多的时节•采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。采样后及时回去分离。《从自然界采集》MarinebacteriumSoilbacterium科文学院土壤的物质组成体积比vol/vol农田土壤上层15cm处微生物数量和生物量微生物土壤中的数量(个/g)生物量（g/m2）细菌放线菌真菌藻类原生动物9.8×1072.0×1061.2×1022.5×2043.0×104160160200328土壤中微生物的分布团聚体周围的等氧线耕地土壤一个团聚体等氧压线，在近中心部位为一缺氧带，由此向外，氧浓度逐渐提高。O2%根际微生物（1）几个基本概念根际根际效应根土比溶胞物质植物黏液渗出物黏质植物黏液渗出物和分泌物植物黏液植物黏液植物根际根际rhizosphere由植物根系与土壤微生物之间相互作用所形成的独特圈带。它以植物的根系为中心聚集了大量的细菌、真菌等微生物和蚯蚓、线虫等土壤动物，形成了一个特殊的生物群落。根土比(R∶S)根际微生物在数量和质量上都与根际以外的微生物不同。根际微生物数量常比根际以外的微生物数量高几倍至几十倍,个别的细菌群可高达上千倍(平板计数)。这两者的数量比称为根土比(R∶S),表示植物根系对微生物的影响程度，所以又称根际效应。土壤剖面结构与微生物垂直分布有机质层淀积层碳酸盐积累疏松母质淋溶层土体层从堆肥中分离嗜热菌我第一次去的采样地点Thermophilicbacteria日本新泻县，石油降解菌日本八幡平，嗜热菌乳温泉玉川温泉嗜酸菌（Acedophilus）海洋生物工程研究所（MarineBiotechnologyInstitute）东京釜石釜石市研究所太平洋京都长冈福冈苍玄海鞘鲍鱼珊瑚海藻Bacillussubtilissubsp.SubtilisIFO13719TA4B171cmInhibitionzone山西省，运城，硝池，嗜盐菌中国的死海山西省，运城，硝池，嗜盐菌烟台的盐场徐州市铜山新区奎河（环境污染物降解菌）3.标本的预处理目的：提高分离几率方法：物理法（温度，膜过滤）如放线菌比G-菌耐热，40℃处理2～6h。海水的过滤浓缩化学法（改变培养基环境）CaCO3提高pH，分离链霉菌诱饵法（钓鱼）野外散布目的物质（污染物，农药）3.标本的预处理2.2菌种的分离1.施加选择性压力分离法2.随机分离法Selectionpressure自然界标本是微生物的混杂物（优势菌株—非优势菌株）优势菌株——直接在平板培养基上划线非优势菌株——富集培养，施加压力，不利于其他菌株的成长，使目标菌株成为优势菌株。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。1.施加选择压力分离法•碳源：特定碳源的利用菌•氧气的控制：区别好氧微生物和厌氧微生物•pH的调节：嗜酸菌和嗜碱菌•温度：嗜热菌和嗜冷菌•培养基的设计•加抗生素或试剂加抗真菌抗生素分离细菌，放线菌加抗细菌抗生素分离真菌•选择培养基中加入酶作用底物，产酶者长•重复使用多种选择压力•控制限制性基质稀释率的连续培养,来富集菌种CarbonsourceActinomycete青霉素革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌肽聚糖青霉素的作用位点革兰氏阳性菌和阴性菌在细胞壁上的区别《培养方法》1.平皿划线分离法a.分区划线分离法b.连续划线分离法《培养方法》3.分批式富集培养将富集培养物的一部分移到同一种培养基内，从新建立选择压力，重复多次。最后接种到平板培养基上分离单菌落。1%选择压力第1次第2次第3次第4次第5次《培养方法》4.恒化式富集培养（连续培养）改变限制性基质的浓度，控制两类不同生长速率的菌株。长处：适用于连续发酵生产，稳定混合菌群的分离（共生菌）例子：唯一碳源甲烷，甲烷营养型和非甲烷营养型液量基质浓度保持一定00.20.40.60.811.202004006008001000SVVmVm/2Kmμ：菌体的生长比速S：限制性基质浓度Ks：半饱和常数μmax:最大比生长速度μ单一限制性基质：就是指在培养微生物的营养物中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。微生物的生长动力学、Monod方程微生物的生长速度：μ＝f(s,p,T,pH,……,)在一定条件下(基质限制):μ＝f(S)2.2菌种的分离1.施加选择性压力分离法2.随机分离法Selectionpressure2.随机分离法（随机但要有经验）生产某些物质的微生物无法利用施加选择性压力法分离。•抗生素产生菌的分离（高灵敏度实验菌）抑菌圈法，稀释法，扩散法，生物自显影法•抗肿瘤药物（借用抗生活性筛选）生化诱导法（BIA）：酶活性分析检测DNA损伤SOS生色检验法：生色反应检测DNA损伤•酶抑制剂靶酶筛选法•抗病毒药物（作用于核苷酸者毒性高）病毒表面，病毒特有的DNA合成酶•生长因子（影印法）培养→影印→杀死→接缺陷性→生长圈→找对应菌落《抗生素产生菌的分离》•抗生素产生菌的分离（高灵敏度实验菌）方法：抑菌圈法，稀释法，扩散法，生物自显影法高灵敏度实验菌底灵敏度实验菌抗生素产生菌的筛选过程•大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平皿上进行的。一般培养4-20天时在平皿上缓慢形成菌落。•在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。•选择性地添加抗生素，抑制细菌的繁殖。•琼脂平皿制备好后，一般皆应在37℃培养箱中存放3天。《放线菌的分离》培养基•土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平皿，培养。•植物体上放线菌的分离：取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平皿表层培养。也可洗下微生物后振荡培养。•水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，浓缩后涂布于平皿上。方法《放线菌的分离》•菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。•通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。•成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基•将分离平皿上所形成的菌落用经火焰灭菌的接种棒或无菌牙签挑取，点接到琼脂平皿上进行影印培养，以进一步筛选和分离。次代培养及纯化《放线菌的分离》《放线菌菌落形态》《抗生素抗性菌——人类》1.细菌产生一种或多种水解酶或修饰酶，水解或修饰进入细菌细胞内的抗生素，使之失去生物活性；2.细菌有一种依赖能量的主动转运机制，能够把进入细胞的抗生素排出体外；3.细菌细胞膜的透性或者其他性质发生改变；4.抗生素的作用靶点由于发生突变。《抗生素抗性菌——人类》MRSA（Methicillin-resistantStaphylococcusaureus）耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（超级细菌）青霉素，氨苄青霉素，头孢霉素，，，甲氧西林青霉素万古霉素（Vancomycin），氨基酸类似物VRE(Vancomycin-resistantEnterococcus）万古霉素抗药性肠球菌《真菌分离》•利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁徙生长。•改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。•有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。•加入抗生素，抑制细菌的生长。培养基《真菌分离》•土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。•植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。•水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。方法抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物基本上作用在核酸生物合成上，微生物与人类的核酸结构和生物合成相似性大，可借用抗生活性筛选抗肿瘤药物。•生化诱导法（BIA）：酶活性分析检测DNA损伤(BacteriaInhibitionAssay)PL启动子lacZ阻遏基因LacZ阻遏蛋白特殊底物显色物质抗肿瘤药物基本上作用在核酸生物合成上，微生物与人类的核酸结构和生物合成相似性大，可借用抗生活性筛选抗肿瘤药物。•生化诱导法（BIA）：酶活性分析检测DNA损伤(BacteriaInhibitionAssay)PL启动子lacZ阻遏基因LacZ阻遏蛋白特殊底物显色物质某种化合物DNA损伤抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离SOS生色检验法：生色反应检测DNA损伤PsifA启动子lacZ阻遏基因LacZ阻遏蛋白活化RecA蛋白DNA损伤分解特殊底物显色物质酶抑制剂产生菌的分离靶酶：生理和病理明确的酶。在体外有抑制靶酶的物质在体内也可能会有药理作用生长因子产生菌的分离目的：寻找谷氨酸生产菌方法：利用谷氨酸营养缺陷型株寻找标本培养影印影印后杀死涂布谷氨酸营养缺陷型菌株缺少谷氨酸的培养基营养培养基缺少谷氨酸的培养基缺少甘氨酸的培养基《要点》1生物物质产生菌的采集微生物是生物活性物质的丰富资源标本采集标本预处理2菌株的分离施加选择压力的分离法随机分离法注意事项生产菌种的来源koko注意事项从自然界中分离微生物伴随着危险注意事项1.避免单独行动2.利用公共交通3.确保联络手段4.通知当地管理人员《对实验室的要求》P1级（非病原菌）一般微生物学实验室，实验室内禁止饮食、吸烟及保存食物，关闭实验室的门窗P2级（未知微生物，不通过空气传染）生物安全操作柜,具备高压灭菌器，UV灯及双重门，不设置水龙头和下水道P3级（病原菌）缓冲室和更衣室，实验室保持负压，进入实验室需戴口罩、鞋套及帽套P4级（高度危险性病原菌）实验室绝对封闭，穿着维持正压的实验衣生物安全操作柜风墙维持正压的实验衣P4级实验室病毒细菌真菌寄生虫P1P2P3P4•自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分小心。尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。•一般，微生物中除啤酒酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。《毒性试验》《菌种的鉴定》纯培养物（Pureculture）单菌落——————————共生现象（Singlecolony）（Symbiotism）16SrDNA测序检索模式菌株（Typestrain）DNA杂交脂肪酸组成Tm值G+C含量和模式菌株对