第六章-种子制备与菌种保藏

第六章发酵菌种的制备与保藏第一节生产菌种的制备过程一、生产菌种制备的概念：生产菌种的制备,即菌种的扩大培养,就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或摇瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。二、种子扩大培养的目的接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间，保证生产水平三、优良种子应具备的条件‣生长活力强，延滞期短；(接种后在发酵罐中能迅速生长)‣生理形态稳定；‣浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求；‣无杂菌污染，保证纯种发酵；‣生产能力稳定。四、种子制备过程生产菌种的制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。孢子制备----实验室阶段摇瓶种子制备----实验室阶段种子制备种子罐种子制备----生产车间阶段步骤：斜面培养基中活化；扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备;一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；种子转种至发酵罐I.孢子制备孢子制备是将休眠状态的孢子经过固体表面进行扩大繁殖再形成成熟孢子的过程。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点。无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅速，可用固体培养基培养孢子。菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇瓶液体培养法。不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度下活化即可。（一）放线菌孢子的制备培养基：琼脂斜面（麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨、无机盐）；干燥和限制营养有利于孢子形成。培养条件：28℃-37℃，5-14d。制备过程：①菌种→母斜面→子斜面→种子罐（冷藏形式）孢子进罐斜面孢子制成孢子悬浮液后直接接入种子罐。制备过程：②菌种→母斜面→子斜面→摇瓶菌丝→种子罐（冷藏形式）摇瓶菌丝进罐斜面孢子经过种瓶培养获得菌丝悬液后接入种子罐。B.注意事项①限制碳源(约1%)和氮源(不超过0.5%)②培养温度多为28℃，少数为37℃，培养时间为5~14天③采用孢子进罐：工艺简单，批间差异小，便于控制孢子质量；采用菌丝进罐：可缩短种子罐内的培养时间(尤适生长缓慢的菌种)(二)霉菌孢子的制备注意事项①天然农产品因具有独特的营养成分和较大表面积而适合作霉菌的培养基②培养温度多为25-28℃，培养时间为4-14天大米孢子制备1、加水浸泡：大米（饱满、完整），用水泡4±1h（大米:水=1:0.5-0.6），凉至半干（能散开，表面无水即可）。2、蒸熟：湿纱布2层垫于塞子内，加入大米，置于搪瓷盘，4层牛皮纸做盖子，塞子100℃、20min蒸熟（若夹生，浸或焖时间长些）。降温至温热时打散，凉半干（米粒散开即可），分装于装罗氏瓶（方形250×150mm），厚度1-2cm。3、灭菌：121℃、20min灭菌，降温至温热时摇散，放置不超过1天，过干可加无菌水。4、接种：1支冻管接3－4个罗氏瓶，每瓶3滴于不同地方，摇匀。培养过程：前两天每天摇一遍。接种前用缓冲液洗下进种子罐。霉菌孢子青霉素小米孢子制备♣1、小米：水=1：0.45-0.5，泡40min。小米加于开水中，搅拌，开锅后焖/捂半小时，然后倒入盘子（垫湿纱布），用4层牛皮纸做盖子，100℃、20min蒸熟，不能夹生（若夹生，延长浸泡时间）。♣2、电扇风吹，米粒散开即可，分装、加塞，灭菌、接种。♣3、胶皮卷的棒敲100下，先直立培养。♣4、48h左右，长菌后（小米由黄变白）平铺：手敲，培养。米孢子制备注意点♣须泡透：泡的时间长一点，再风干；♣培养相对湿度：70%以上；♣罗氏瓶装量：3-4粒米厚；♣培养后，玻璃珠打碎，洗下孢子接种，或火焰接种直接倒入种子罐。(三)细菌孢子的制备多采用限制碳源而氮源丰富的培养基。培养温度多为37℃，少数为28℃。菌体培养时间多为1-2天，产芽孢的细菌多为5-10天。实验室阶段种子培养物选择的原则A.目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：对于不产孢子和芽孢的微生物——获得一定数量和质量的菌体如:谷氨酸的种子培养。对于产孢子的微生物获得一定数量和质量的孢子较菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子。如:灰色链霉菌孢子的培养培养基选择原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，或者有利于孢子的产生。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。起始接种物的传代问题细菌保藏斜面→活化斜面产孢子保藏斜面→母斜面→子斜面目的：使菌种的传代次数尽可能的少。孢子培养母斜面：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。子斜面:大量繁殖，得到大量孢子。接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落②接种时密一点，得到大量的孢子。孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月II.种子制备概念：指将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基种培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。种子制备所使用的培养基和其它工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌体繁殖。摇瓶种子＋种子罐种子（一）摇瓶种子制备摇瓶菌丝进罐：母瓶→子瓶→进罐母瓶→进罐营养要求：比较丰富和完全，并易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。各种营养成分不宜过浓，子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近种子罐的培养基配方。（二）种子罐种子制备二级发酵利用一级种子所进行的发酵。三级发酵利用二级种子所进行的发酵。四级发酵利用三级种子所进行的发酵。二级种子发酵罐斜面孢子或摇瓶菌丝一级种子三级种子种子制备过程：工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数谷氨酸：二级发酵（谷氨酸棒杆菌）摇瓶→一级种子（小罐）→发酵青霉素：三级发酵一级种子（小罐）→二级种子（中罐）→发酵链霉素：四级发酵一级种子→二级种子→三级种子→发酵发酵级数确定的方法种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来的染菌的机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。发酵级数确定的依据级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。对于生长快的细菌，种子用量比例小，故种子罐相应也少。如：谷氨酸生产中，采用茄瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于32℃培养7～10h，菌体浓度达108～109个/ml，即可接入发酵罐作为种子。这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，其孢子悬浮液接入一级种子罐扩大培养于27℃培养40h，此时孢子发芽，长出短菌丝，再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐，于27℃培养10－24h，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐作为种子。这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵.生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养（四级发酵）在小型罐（5～500L）中进行实验时，通常采用直接将孢子或菌丝体接入罐中发酵，这可称为一级发酵。生产车间阶段种子培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌体或菌丝体。菌丝体比孢子要有利：缩短发酵时间有利于获得好的发酵结果目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本二是驯化例：柠檬酸发酵（黑曲霉）以蔗糖为原料成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%琼脂2%薯干粉成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁薯干粉10%22-28%(NH4)2SO40.5%琼脂2%种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备制备过程斜面种子摇瓶种子培养一级种子培养发酵1、斜面培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5琼脂2%，pH7.0-7.2培养条件：32℃，生长18-24小时培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次2.摇瓶种子培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，K2HPO40.1%培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml，32℃培养12小时。培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基3.一级种子(种子罐)培养基：和摇瓶种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32℃培养7-10个小时培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基种子的质量要求：108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列PH7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛二、青霉素生产的种子制备制备过程安瓿瓶斜面孢子大米孢子一级种子培养二级种子培养发酵1、斜面孢子培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培养条件：25℃、7天,注意湿度50%左右培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细2、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养条件：25℃、7天，控制湿度培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当，有利于孢子的生长。大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子3、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培养条件：27℃，40小时接种量：200亿孢子/吨目的：长菌体4、二级种子培养基：同上培养条件：27℃、10-14小时接种量：10%种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空泡，处于Ⅲ—Ⅳ期。青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强。第二节生产菌种的质量控制一、影响孢子质量的因素1、培养基a）培养基的原材料的产地、品种、加工方法和用量对孢子质量都有一定影响。原材料质量波动的主要原因：无机离子含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）。如：四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量均有一定影响。制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同。蛋白胨加工原料不同（如鱼胨或骨胨）对孢子影响也不同。b）水质波动引起孢子质量不稳定。减少水质影响的方法：在蒸馏水或无盐水中加入适量无机盐，供配制培养基使用。解决措施：a)斜面培养基的主要材料经化学分析和摇瓶发酵试验合格后才能用于孢子培养基。b)应保证培养基灭菌后的质量。c)水份适中有利于孢子生长，因此斜面培养基使用前应于一定温度下放置一定时间，使斜面无冷凝水。d)供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。2、培养条件a)温度温度过低，菌种生长发育缓慢。温度过高会使菌丝过早自溶。适当提高培养温度，可加速菌体代谢，缩短培养时间，但不可超过菌体敏感温度温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响。如：在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。b)湿度放线菌一般要求相对湿度较低；真菌一般要求相对湿度较高。相对湿度对孢子形成的速度、数量和质量均有影响。不同湿度对龟裂链霉菌（产土霉素）斜面生长的影响