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第四章种子制备与菌种保藏•第一节种子制备（Inoculumdevelopment）定义：由保藏的菌种开始，经过逐级扩大培养，最后获得供生产车间发酵罐接种的的足够数量和优质质量的种子。生产菌种的必备条件：1生长快：2对环境条件要有比较大的承受能力3遗传表现型要稳定，不易退化4菌种要纯斜面沙土管冷干管液氮管实验室种子制备生产现场种子制备生产种子制备的一般流程二级斜面一级斜面米孢子母瓶子瓶一级种子罐发酵罐二级种子罐三级种子罐菌种保藏•几个概念种子罐级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数。发酵级数：种子罐的级数加一。接种量：放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液的体积的百分数。种龄：生产种子的培养时间。一斜面种子的制备1.斜面种子：在试管或扁瓶内，以琼脂固化的培养基表面上生长的菌种培养物。2.制备流程：3.制备过程注意事项(1)琼脂要完全浸没在营养液内,用量1.0%-2.5%(2)营养液中最好不含易沉淀的固形物；(3)装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度的2/3；(4)灭菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以减少冷凝水(5)微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入在无菌间超净工作台进行接种操作3.质量检查(1)外观检查(2)无菌检查(3)摇瓶生产能力检查4.影响斜面种子质量的因素(1)原材料质量，水质，培养基pH，(2)灭菌条件，(3)接种量，(4)培养室温度、湿度、通风、(5)培养时间，(6)有害气体或挥发物（培养室内不要安紫外灯）(7)冷藏条件二、米粒种子（米孢子）•1.米孢子：将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。•2.米孢子制备工艺流程•3.制备过程注意事项（1）浸泡时间及加营养液量应掌握在灭菌后米粒熟透但不粘连；（2）分装量应掌握在平铺后有2-3粒米的厚度（3）米粒不要碰到瓶塞；（4）培养前期应经常摇动米粒，使微生物在米粒表面生长均匀，气生菌丝及孢子长成后不再摇动。（5）保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存4.质量标准（1）无杂菌污染（2）孢子数足够，发芽率高（3）生产能力高(4)真空干燥后含水量小于8%5.影响质量的因素及控制（同前）三、种曲（培养材料用麸皮、米糠等，其余同米粒种子）四、摇瓶种子1.摇瓶种子:将斜面种子或米孢子接种于锥形摇瓶内的液体培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子。2.制备流程:3.制备过程注意事项1)培养基营养成分含量应较斜面丰富，以确保一定的营养菌体生长量；能保持生长过程中pH稳定。2)培养基装量适当，以保证良好的通气并与发酵罐通气条件相适应；参考装量为40-50ml/250ml瓶，60-80ml/500ml瓶，90-110ml/750ml瓶，120-150ml/1000ml瓶；如果是厌氧培养，则装量应增加一倍以上；3)灭菌时要注意不要让蒸汽冷凝水打湿或粘污培养基在瓶塞或纱布上4）注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。经常检查，皮带松弛时要紧一紧。5）注意摇床中心与边缘、上层与下层的温差摇瓶种子制备流程3.质量检查：(1)菌体浓度：外观稠度，静置沉降率，离心沉降率。(2)菌体生长阶段：显微镜检查细胞分化情况。(3)代谢情况：对残余糖、氮进行化学分析，并测量pH值。(4)生产能力：摇瓶发酵试验。(5)污染杂菌情况：镜检及无菌试验检查4.影响质量的因素•五、发酵罐种子1.制备流程：斜面、摇瓶或米粒种子↓培养基配制→实罐或连续灭菌→冷却→火圈或压力差接种→培养→发酵罐种子2.制备过程注意事项1)培养基要求与发酵培养基大致相同，较摇瓶培养基丰富，控制培养基成份的合理配比，2)接种方式：一级种子罐：火圈保护接种法和压差法二级种子罐：压差法3）通气培养时通入空气的温度适中（20-50℃），搅拌转速也要适当。4）采用夹套或蛇管冷却以保持恒温，温度不能高于控制温度，防止造成异常发酵5）通过培养基中生理酸碱性物质的配比，使pH自然维持在适宜的范围6）控制合适移种量：确定合适的移种量：过大或过小都对发酵有不利影响掌握种子罐的放罐体积。移种方式：压差法接种操作示意种子罐1发酵罐1发酵罐2种子罐21）单种2）双种3）倒种4）混种①①②③④•3.质量检查及质量标准：1）不污染杂菌2）菌体生长阶段（种龄）：处于对数生长期后期，菌体量未达到高峰3）菌体浓度：菌体浓度的测定方法：离心沉淀法、光密度法、细胞记数法等4）糖、氮、磷代谢情况5）种子液pH6）摇瓶试验的发酵水平7）特异性酶活力种龄对发酵的影响种子液的pH值反映种子的状态时间pH6.724•4影响质量的因素•5种子代谢缓慢原因分析空气温度偏低局部烫伤培养基原材料质量差培养基灭菌温度太高，营养成分破坏多无机磷量低接种量太小前一级种子质量太差泡沫多通气差第二节菌种保藏（strainconservation)•定义：将有用的微生物以特定培养形态在特定的环境条件下存放，以保持种的存活、纯粹和遗传性状的稳定。•一、条件及原理•1.低营养•2.干燥•3.隔氧•4.低温•降低代谢速率或使细胞处于休眠状态5.密封保持干燥、隔氧、纯粹中国微生物菌种保藏中心中心名称缩写所在地邮码保藏范围中国典型培养物保藏中心普通微生物菌种保藏中心农业微生物菌种保藏中心工业微生物保藏中心医学微生物菌种保藏管理中心抗生素菌种保藏管理中心兽医微生物菌种保藏中心林业微生物菌种保藏中心CCTCCCCGMCACCCCICCCMCCCACCCVCCCFCC武汉大学中国科学院微生物研究所中国科学院病毒研究所中国农业科学院土壤肥料研究所轻工部食品发酵工业研究所中国医学科学院皮肤病研究所中国药品生物制品检定所中国医学科学院医药生物技术研究所国家医药管理局四川抗生素工业研究所华北制药厂抗生素研究所农业部兽医药品监察所中国林业研究所武汉430072北京100080武汉430071北京100081北京100027南京210042北京100050北京100050成都610051石家庄050015北京100081北京100091专利菌种真菌，细菌病毒农业微生物工业微生物真菌细菌抗生素产生菌新抗生素产生菌抗生素工业生产菌种兽医微生物林业微生物•AmericanTypeCultureCollection(ATCC),UnitedStatesofAmerica.•NationalCollectionofTypeCultures(NCTC),UnitedKingdom.•InstituteforFermentation,Osaka(IFO),Japan.•二、常用的菌种保藏方法1单纯传代保存法（斜面或穿刺）4℃冰箱或15℃室温，保存期3-6个月适用于细菌或酵母2结合单孢子分离的传代保存法斜面→孢子悬浮液→稀释涂布→单细胞分离培养→挑菌→高产菌株的筛选→高产菌株的保藏4℃冰箱或15℃室温，3-6个月适用于遗传不稳定的菌种,既保藏了菌种，又保持了生产能力3米孢子保存密封，4℃冰箱3-6个月；真空抽干后密封，保藏6-12个月。适用于霉菌的保藏4庭院土保藏法灭菌庭院土为保藏介质，培养，真空干燥，密封4℃冰箱一年以上保存期适用于霉菌、放线菌和形成芽孢的细菌的保藏5沙土管保存过筛、灭菌并干燥的沙土为保藏介质，接种，真空干燥、密封，4℃冰箱保存，1-3年保存期。适用于霉菌、放线菌和形成芽孢的细菌的保藏6孢子或营养细胞悬浮液保存悬浮于灭菌的10%-20%甘油介质，低温冰箱（-50--70℃）1-2年7冷冻干燥管保存（lyophilizationfreeze-drying)收集菌种灭菌脱脂牛奶或马血清作为悬浮介质灭菌安瓿管预冻真空冻干密封，4℃冰箱，保存3-5年适用于一切微生物的保存细胞10%-20%甘油作为悬浮介质分装入无菌聚丙烯管预冻置液氮内（-196℃），保存5-10年适用于所有微生物、动物和植物细胞的保存8液氮管保存(storageinliquidnitrogen)9、基因工程菌的保藏•由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。•一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。•当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。•我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。•普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）中国科学院微生物研究所，北京中国科学院武汉病毒研究所，武汉。•农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）中国农业科学院土壤肥料研究所，北京。•工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）中国食品发酵工业科学研究所，北京。•医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）中国医学科学院皮肤病研究所，南京中国药品生物制品检定所，北京。中国预防医学科学院病毒学研究所，北京•中国抗生素菌种保藏管理中心（CACC）中国医学科学院医药生物技术研究所，北京；四川抗生素工业研究所，成都；华北制药集团抗生素研究所，石家庄。•兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）中国兽医药品监察所，北京。•林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC）中国林业科学研究院，北京。•中国典型培养物保藏中心（CCTCC）武汉大学，武汉。