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第六章植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产•1983年，日本三井石油化学工业公司在世界上首次成功地采用紫草细胞培养工业化生产紫草宁。北京锦绣大地农业股份有限公司植物次生代谢产物概述2细胞的初代培养3高产细胞系的筛选4植物细胞悬浮培养方法5植物次生代谢物质生产1.1植物代谢产物（1）初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必须的代谢。初生代谢过程中形成的各种产物为初生代谢产物。初生代谢产物不稳定，在体内容易发生转化。（2）次生代谢：建立在初生代谢基础上，对于植物的正常生长发育非必需的代谢，其代谢产物为次生代谢产物，次生代谢产物是末端代谢产物，比较稳定，可以在体内积累。类别次生代谢产物用途黄酮银杏黄酮，大豆黄酮治疗心血管疾病醌紫草宁抗菌、抗炎、抗病毒、止血简单酚类香豆素香料，抗菌消炎萜类紫杉醇抗癌青蒿素抗疟疾生物碱长春新碱抗癌奎宁抗疟疾酚类化合物长春碱：＄2million/kg长春新碱：＄15million/kg•李时珍在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。天然的次生代谢产物已经超过2万种。次生代谢产物的应用：色素、香料、药物、添加剂、工业原料等。•紫杉醇：二萜类化合物•最早由太平洋红豆杉Taxusbrevifolia的树皮中分离•广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几种癌症•目前主要来源于红豆杉属植物紫杉醇简介市场需求抗癌一线用药销售额年增长率5亿美元理论需求量2g/人,500万人/年1000kg/年实际销量350kg/年紫杉醇供需相差十分悬殊0.83.46.61214.818.22025051015202530199219941995199819992000200120023003504806207801000020040060080010002000年2002年2004年需求量图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）药源问题•红豆杉主要原料植物国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种之一•生长缓慢分布有限Taxol含量低树皮中Taxol含量:0.00001-0.069%3000棵树=10吨树皮=1kgTaxol=500病人700岁的红豆杉惨遭剥皮–人工栽培采用种子繁殖、扦插等无性繁殖方法快速、大面积人工繁育红豆杉幼苗–寻找红豆衫的替代物从红豆杉非树皮部位提取产紫杉醇的非红豆杉植物药源问题解决办法（一）药源问题解决办法（二）–化学合成•全合成1994年获得成功现有六种途径•半合成以10-DABⅢ和BaccatinⅢ作为半合成原料获得紫杉醇药源问题解决办法（三）–生物方法•组织和细胞培养•微生物发酵•生物合成研究阶段红豆杉生物合成途径基本明确10种相关酶基因被克隆表达利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量1.2获得植物次生代谢产物的方法从植物中提取化学合成植物细胞大规模培养生产次生代谢产物植物细胞具有形态全能性，化学全能性（在离体的条件下可以合成整株植物能合成的物质）自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较生产方式生产周期紫草宁含量（％干重）完整植物2～3年1～2植物细胞培养3周14•细胞培养是生产次生代谢产物的理想途径：①缩短周期，提高生产效率植物细胞培养生产周期为15-30d；而完整植株生长短则几个月，长则数年，如木瓜8个月，而紫草为5年②易于管理，减轻劳动强度③培养在无菌条件下进行，可排除病虫害干扰④可探索新的合成路线，获得新的有用物质1.3植物细胞悬浮培养：即是将植物细胞或小的细胞团在液体培养基中进行大规模培养的技术。成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。细胞分裂快，均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。有效成分含量高。次生产物的产量=细胞量*细胞次生代谢产物的产率可控遗传因素决定植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易聚团等特点。植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累和分离。适合植物细胞培养的反应器应具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。2细胞的初始培养实验中获得适宜于悬浮培养的细胞系的过程称为细胞的初始培养。2.1建立悬浮系获取悬浮培养的细胞细胞的振荡培养酶解法愈伤组织培养法使细胞团分散促进气体交换搅拌培养；旋转振荡培养；旋转培养培养方式：2.2建立良好的悬浮系的关键环节1.选择适宜的外植体双子叶植物：幼胚、成熟胚、下胚轴、叶片单子叶植物：幼胚、成熟胚、幼穗、花药等2.诱导疏松愈伤组织；培养基愈伤组织的异质性；继代培养3.选择适宜的培养基；基本培养基+CTK/AUX+天然复合物eg:SH+NAA3.0+BA1.0+CM/YE培养基的PH李忠光，龚明.2006.74.悬浮培养初期的控制转速，光，温度5.悬浮细胞的继代与选择继代中收集小的细胞团条件培养基：新鲜培养基3高产细胞系的筛选(P113)3.1高产细胞系筛选的整体思路外植体愈伤组织的诱导筛选悬浮培养细胞高产细胞系筛选高产细胞系的建立高产细胞株系的特点•培养细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物•细胞生长及产物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物•代谢产物要在细胞中积累，而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中高产细胞系的筛选过程⑴选定特定起始材料①准确选择能够产生目的代谢产物的植物种类、品种或单株②应尽量选择自然状态下产生天然产物的组织或器官为外植体⑵诱导愈伤组织，并获得单细胞悬浮液⑶诱变处理细胞悬浮液，筛选目的突变细胞⑷通过单细胞培养突变细胞，获得突变细胞无性系（即突变细胞愈伤组织获得）高产细胞系的筛选方法⑴目测法注意：真正的变异体or生理状态不同的细胞克隆⑵根据单细胞克隆次生代谢产物含量进行筛选⑶抗性筛选如：添加抗性抑制剂庚二酸------生物素⑷诱变筛选3.2高产系的稳定性及保存方法尽量减少继代次数，用矿物油包埋法，低温保存法（0-4℃），超低温保存法（-196℃）保存。同时从高产系中不断克隆形成新的高产细胞系。4植物细胞悬浮培养的方法悬浮培养：将游离的细胞或者细胞团按一定密度，悬浮在液体培养基中，不断搅拌或者振荡培养，使细胞快速、大量增殖。技术难点：通气、剪切力的适应性；细胞同步化控制。①培养：培养基：基本培养基+CTK/AUX培养条件：温度、氧气、PH、转速②同步化控制③细胞增殖的监测，适时测定细胞的数量，掌握放罐时机。4.1细胞悬浮培养的方法(P117)分批培养法连续培养法半连续培养法细胞固定化培养分批培养：把细胞分散在一定溶积的培养基中进行培养。注：中途不添加也不更换培养基设备简单，操作方便，重复性好。适合与突变体筛选和遗传转化的研究。•悬浮培养细胞增殖曲线时间（d）细胞数量123451——滞后期、2——对数生长期3——直线生长期、4——减缓期5——静止期（1）细胞扩增生长成S形曲线（2）继代培养：要求缩短滞后期滞后期的长短：a继代细胞所处的生长时期；对数期b继代的细胞密度104-105个/ml连续培养：在培养过程中，不断向反应器中以一定流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中取出培养基及培养物的方式。加入培养基排出培养基及其培养物半连续培养：在完成分批培养的一个周期后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的方式。细胞固定化培养：将细胞固定在固相基质上，放入培养液进行培养的方式。悬浮培养反应器的类型：机械搅拌式反应器气动式反应器内循环气升式外循环气升式机械搅拌式内循环气升式外循环气升式4.2培养基：与培养的细胞密度相关（1）高密度悬浮系（5*104个/ml）a用B5，ER等专用培养基b对传统培养基做出改良如：加大2,4-D用量；改良MS，加入VB、CH等天然复合物（2）低密度悬浮系（5*104个/ml）a条件培养基b向培养基中添加多种成分，尽可能满足细胞生长的需要细胞同步化：同一悬浮培养体系的大多数细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。细胞培养的同步化方法：饥饿法：限制必需物质的供应抑制法：化学抑制，物理抑制分级培养：细胞分级仪4.3悬浮细胞培养的同步化(P121)4.4悬浮细胞的生长量和活力分析(P122)（1）测定悬浮细胞数量的方法：①细胞计数-血球计数板②鲜重、干重的测定③细胞密实体积(PVC)（2）细胞活力测定①二乙酸荧光素法（FDA）-活细胞内有荧光产生②伊凡兰染色法-染色受损细胞核---死细胞③相差显微镜法-胞质环流是否存在5植物细胞大规模培养生产次生代谢物质植物细胞大规模培养的技术要求：从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和次生代谢产物生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件：1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。5.1技术路线(1)选择适宜的外植体；诱导疏松愈伤组织；(2)通过含量分析，选择高产细胞系(3)研究培养条件（达到高产、稳产）；(4)建立悬浮细胞培养、优化培养条件（达到高产、稳产）；(5)小试、中试、优化培养条件；(6)大规模培养；(7)工业化生产，产品分离，纯化。5.2提高次生代谢产物产量的方法（1）筛选高产细胞系不同植物种类，不同植株及同一植株的不同部位，往往有不同的代谢能力；通过人工诱变改良细胞系；通过遗传改良筛选细胞系。云南红豆杉东北红豆杉中国红豆杉南方红豆杉杂种红豆杉筛选出的高效、高产细胞株系，有的植物细胞系其高效、高产性能稳定多年，但有的植物细胞系不稳定，因此，还需要定期检测，更新细胞株系。•培养基的营养成分一方面要满足植物细胞的生物量增长，另一方面要使细胞能合成和积累次生产物。故在生长的第一阶段使用生长培养基；第二阶段使用生产培养基•一般来说增加培养基的N、P和K浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度则有利于次生产物的合成；而激素需根据实验确定•适于植物细胞悬浮培养的基础培养基主要是B5和ER（2）优化培养基基本培养基+激素+天然复合物（3）改善培养条件对于任何一种细胞培养，培养条件都要通过多次的试验摸索确定。eg:在胡萝卜愈伤组织培养中，光照条件使紫红色愈伤组织能够生成大量的花箐苷，并且低温条件下，生成量高。（4）培养基中添加前体物质•在细胞内次生代谢物质是以初生代谢物质为原料，经过一系列的化学转化而合成的，因此，每种次生代谢产物都有一条生物合成途径。•前体物质：次生代谢物质生物合成途径的中间体物质烟草愈伤组织培养中，将前体物质—烟碱酸加入，会增加烟碱的生成量。第一步：解决生物量生产（促进细胞分裂）；第二步：促进次生代谢物合成，即在细胞指数生长停止期前后才更换培养基，有利于次生物质的积累。（5）二步培养法（6）使用诱导子诱导子是能刺激细胞合成次生产物的物质A生物诱导子：微生物菌丝、提取物、多糖、蛋白质类等；植物细胞碎片、寡聚糖等B非生物诱导子：辐射、金属离子