转基因小鼠生产过程的优化

转基因小鼠生产过程的优化作者：郑敏，王莉莉，王美丽，牛慧玲，戴蕴平，ZHENGMin，WANGLi-Li，WANGMei-li，NIUHui-Ling，DAIYun-Ping作者单位：郑敏,王美丽,牛慧玲,ZHENGMin,WANGMei-li,NIUHui-Ling(北京基因达生物科技有限公司,北京,100094)，王莉莉,戴蕴平,WANGLi-Li,DAIYun-Ping(中国农业大学农业生物技术国家重点实验室,北京,100094)刊名：农业生物技术学报英文刊名：JOURNALOFAGRICULTURALBIOTECHNOLOGY年，卷(期)：2004，12(6)引用次数：1次参考文献(5条)1.GordanJ-WGenetictransformationofmouseembryosbymicroinjectionofpurifiedDNA19802.成国祥.徐少甫Modelabouttramnsgenicmiceandstudyoflifesciences1994(3,4)3.王敏康.刘冀珑.张田Embryotransferinthemouse2000(6)4.BristerH-L.ChenN-Y.TrumbauerMFacteosaffectingtheefficiencyofintroducingforeignDNAintomicebymicroinjectingeggs19855.HoganBrigid.LacyElizabethManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual1986相似文献(10条)1.期刊论文史洪才.玛依拉.黄俊成.刘明军.李建华.郭志勤移植方法和培养液对显微注射生产转基因小鼠的影响-西北农林科技大学学报(自然科学版)2003,31(2)研究了移植方法和培养液对显微注射法生产转基因小鼠的影响.结果表明,小鼠受精卵显微注射外源基因后,进行单、双侧输卵管移植,受体的妊娠率分别为34.4%和37.5%(P0.05),差异不显著;但仔鼠成活率分别为83.6%和97.2%(P0.05),差异显著.用M2和改良的M2培养液作为显微注射及移植工作液,体外培养的囊胚率分别为17%和35%(P0.01),差异极显著,体内发育的情况也与这一结果相似,妊娠率分别为35.9%和62.5%(P0.05).表明改良的M2培养液的成分结构更适合小鼠胚胎发育的要求.2.学位论文郑敏利用显微注射技术制备大片段基因和双基因转基因小鼠2006DNA显微注射技术虽然因为相对低效、整合随机等问题受到很多争议，但此技术具有对所转基因片段大小无限制，可同时实现多基因注射和转基因不用标记等优势，使其仍是制备转基因动物最为广泛的技术。转基因小鼠对于建立人类疾病模型，揭示发病机理，探索治疗途径具有十分重要的意义，同时转基因小鼠在真核生物基因表达调控机制的研究以及外源基因在大家畜整合表达的预测等方面发挥着重要作用，所以制备转基因小鼠有着重要的研究意义。本实验以显微注射技术制备了大片段基因和双基因转基因小鼠。制备大片段转基因小鼠时是以BAC为载体的140kb人乳铁蛋白基因(Humanlactoferrin.hLF)为目的基因进行的显微注射，注射了1840枚原核期受精卵，移植了80只受体，出生111只子鼠，检测得到10只阳性鼠，出生率为50％，阳性率为9.0％，与以质粒为载体的小片段转基因相比较，出生率和阳性率均没有显著差异。阳性原代鼠中有7只将所转基因遗传给了后代，3只未将所转基因遗传给后代。从阳性原代鼠整合目的基因的完整性分析得出，除两只不完整外其余阳性鼠均整合了完整的目的基因。制备双基因转基因小鼠时是以肾综合征出血热(HemorrhagicFeverwithRenalSyndrome,HFRS)抗体的重轻链基因和岩藻糖转移酶2，3(fucosyltransferases2,3,FUT2,3)基因为目的基因进行的显微注射。其中制备HFRS抗体的重轻链基因的转基因小鼠时注射1350枚原核期受精卵，移植了60只受体，出生了75只子鼠，检测得到6只双基因共整合阳性鼠，阳性率为8％，重链基因整合鼠12只，比率16％。轻链基因整合鼠6只，比率8％。在制备岩藻糖转移酶2，3(FUT2，FUT3)基因的转基因小鼠时，注射1050枚原核期受精卵，移植了42只受体，出生了80只子鼠，得到9只共整合阳性鼠，阳性率为11.3％，FUT2基因整合鼠11只，比率13.8％。FUT3基因整合鼠13只，比率16.3％。共注射均得到了共整合的转基因阳性鼠。共注射双基因共整合的效率不低于仅整合单基因的效率；共注射双基因的整合效率与单基因注射整合效率没有差异。对于HFRS抗体基因阳性鼠的传代显示共整合基因在子一代出现了分离，而岩藻糖转移酶基因阳性鼠传代显示子一代阳性鼠双基因均未发生分离。3.期刊论文范志强.扈荣良.王太一.王禄增.姚汝强.姚伟.FANZhi-qiang.HURong-liang.WANGTai-yi.WANGLu-zheng.YAORu-qiang.YAOWei一种改进的显微注射用DNA片段的纯化方法-中国实验动物学报2006,14(3)目的显微注射用DNA的纯度是影响转基因动物制备成功与否的重要因素,本文建立一种可行的适用于普通实验室的纯化DNA方法,替代普遍使用的试剂盒纯化方法.方法分别使用酚-氯仿多次抽提法及常规的凝胶提取试剂盒纯化含有蚓激酶基因的DNA片段,通过显微注射技术将纯化的DNA片段导入小鼠受精卵的原核,制备转基因小鼠.根据转基因实验的结果对两种方法进行比较.结果使用两种方法纯化DNA均能获得转基因小鼠.在DNA纯度及注射卵的存活率上,两种方法无明显差别;在移植卵的出生率及转基因阳性率上,抽提法优于试剂盒法.结论本实验建立的抽提方法可以替代试剂盒方法纯化显微注射用DNA片段,在降低实验成本、简化实验条件及提高转基因阳性率方面具有优势.4.学位论文刘述文人纤溶酶原激活物抑制物1转基因小鼠的建立1999目的:以显微注射方法构建人纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)转基因小鼠,观察转基因小鼠的表型,检测PAI-1在转基因小鼠的表达情况.并以该小鼠为动物模型,进一步研究PAI-1在调控肾脏疾病细胞外基质降解中的作用.方法:利用构建的真核高效表达载体pCAGGS-PAI-1,经核酸内切酶消化、氯化铯密度梯度超速离心制备显微注射用DNA.以显微注射方法将目的DNA注入小鼠受精卵雄原核,再将注射后成活的受精卵移植到受体母鼠输卵管,制备转基因小鼠.再经PCR筛选、Southern杂交、DNA序列测定对转基因小鼠进行鉴定.观察转基因小鼠的表型,Northern杂交、Western杂交对PAI-1表达进行检测.结论:该研究建立了以显微注射技术构建转基因小鼠的方法,并成功建立了人PAI-1基因转基因小鼠,为进一步研究PAI-1在肾脏疾病中调控细胞外基质降解的机理提供了动物模型,为临床利用抗凝、促纤溶疗法治疗慢性增殖性肾炎提供了理论及实验依据.5.期刊论文王勇.刘勤.倪勇.魏泓.孙新民.赵永聚.WANGYong.LIUQin.NIYong.WEIHong.SUNXin-ming.ZHAOYong-ju通过双原核显微注射提高转基因小鼠研制效率的实验研究-中国实验动物学报2005,13(3)目的建立高效的转基因小鼠制备技术,为开展遗传工程动物模型研究奠定技术基础.方法通过向小鼠受精卵原核中注入不同浓度的DNA分子,筛选最适注射用DNA浓度;将K14/hCTLA4-Ig基因表达载体分子通过显微注射分别导入小鼠受精卵雌、雄原核,并设立单原核注射对照组;利用输卵管腹壶部穿刺移植法将注射后的小鼠受精卵移植于同期发情的受体母鼠;利用PCR对出生的转基因首建小鼠进行筛选.结果最适DNA分子浓度为10ng/μl;在单、双原核注射组:胚胎2细胞卵裂率分别为52.3%(132/253)和45.0%(108/240),差异有显著性(P＜0.05);注射胚胎移植后体内存活率分别为18.1%(24/132)和16.7%(18/108),差异无显著性;转基因首建小鼠阳性率分别为3/24和5/18,转基因阳性小鼠占总注射胚胎的比例为1.2%(3/253)和2.08%(5/240),差异有极显著性(P＜0.01).结论尽管双原核注射对胚胎的2细胞卵裂率有一定影响,但通过双原核注射可有效提高转基因小鼠的制备效率.6.学位论文韦相才制作敲除β'maj&β'min基因及转入人β'654地中海贫血基因双转基因小鼠的研究2005β地中海贫血(简称β地贫)是一种以溶血性贫血为临床表现的血液遗传性疾病。同时，β地中海贫血是一组具有异质性的遗传性疾病。本研究主要内容包括以下三部分：第一部分转基因技术制作人地中海贫血β654转基因小鼠的研究目的:1.探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时，外源基因的制备方法;2.采用雄原核显微注射技术，将人地中海贫血护54基因导入受精卵制作转基因小鼠模型的技术和方法;3.采用荧光定量RT-PCR技术分析所制作的人地中海贫血β654珠蛋白基因转基因小鼠模型mRNA的表达情况，评价该技术应用于小鼠mRNA分析的价值。结论:1.采用基因克隆方法构建的含人地贫β654基因的重组质粒，可获得用于显微注射转基因的外源基因，为进一步制作转基因小鼠打下基础;2.采用雄原核注射技术将人地贫β654基因转入受精卵中，成功获得了转基因小鼠，为人地中海贫血的治疗提供了有效的小鼠模型。3.荧光定量RT-PCR法检测人地贫β654基因的表达结果表明转基因小鼠FO代、F1代所表达mRNA量无显著差异，mRNA在传代后保持稳定。所建立的荧光定量RT-PCR技术分析转基因小鼠mRNA表达具有检测定量、敏感、高效快捷的特点，该方法在鉴定和评估转基因小鼠mRNA的表达中稳定性好、定量准确，具有非常重要的应用价值。4.转基因小鼠的血液学研究数据表明无异常，除了β珠蛋白基因调控基因家族复杂的调控机制受到影响外，更主要是因为鼠内源正常β珠蛋白基因的表达所至。研究提示，通过胚胎干细胞基因打靶途径，获得的β珠蛋白基因基因敲除鼠，再通过β珠蛋白基因敲除鼠与导入人的β珠蛋白转基因小鼠鼠间的交配，则可获得既能表达人地贫β654突变基因，又能表现出贫血特征的Knock-in/Knock-out小鼠，因此，人地贫β654珠蛋白基因转基因小鼠模型的建立为下一步研究提供了良好的工作基础。第二部分基因敲除技术制作敲除βmaj及βmin基因小鼠的研究目的:1，构建C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因打靶载体，为胚胎干细胞基因打靶提供适宜的载体基础;2.建立C129小鼠敲除β珠蛋白基因内源性β珠蛋白及基因ES-D3细胞系，为制作基因敲除嵌合体小鼠提供稳定的胚胎干细胞系。3.建立C129小鼠敲除β珠蛋白基因内源性珠蛋白及基因ES-D3细胞系基础上，制作基因敲除嵌合体小鼠。4.将前一部分研究所获得的人地贫β654珠蛋白基因转基因小鼠模型，与β珠蛋白基因βmaj及βmin敲除鼠种群繁殖，与鼠间的交配，则可获得既能表达人地贫β654突变基因，又能表现出贫血特征的双转基因小鼠模型。结论:1.所构建的C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因置换型打靶载体获得成功，可用于后续的胚胎干细胞基因打靶。2.应用敲除βmaj及βmin基因置换型打靶载体在胚胎干细胞水平进行基因打靶后，获得了稳定的敲除β珠蛋白内源性珠蛋白βmaj及βmin基因的胚胎干细胞系，可用于制作基因敲除嵌合体小鼠的研究。3.采用了敲除βmaj及βmin基因的ES细胞系作为供体细胞，制作基因敲除嵌合体小鼠作获得成功。研究结果显示敲除基因ES细胞系制作嵌合体小鼠为ES细胞介导的转基因动物制作增添了一条新的途径，在人类疾病动物模型制作和人类疾病发病机制研究方面的应用具有重要价值。4.所获得敲除βmaj及βmin基因小鼠有望进一步繁殖回交，获得稳定的生殖系嵌合，再与所建立人地中