多靶点pCRISPR载体

CRISPR-derivedgenomeeditingtechnologyApYLCRISPR/Cas9-MT(II)vectorsystemfortargetingmμltiplegenesitesofdicotplants华南农业大学刘耀光实验室1.CRISPR-Cas9核酸酶切靶序列原理图示：2相关载体图谱2.1CRISPR—gRNAvector：注：用载体骨架隔开U6启动子和gRNA区，可以避免没有被BsaI切断的空载分子被PCR扩增，见后面说明5’NNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTargetSiteNGGPAMNNNNNNNNNNNN-3’3’NNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNN-5’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN5’-G/ANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAACGAUAGAAAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUUCas9nucleaseCleavagesitegenomesequencegRNARuvC-likedomainHNHdomainCUUGAAAAAGUGGCACCGAGCGUGGCUUUUUU-3’BsaI酶切方式:ggtctcNNNNNNN-33-ccagagNNNNNNNPAtU6=ArabidopsisU6promotergRNABsaITTTTTTpU6-gRNA(4kb)AmpR+KanRBsaIPAtU6（基于pEasy-Blunt载体）BsaISpeISpeIPAtU6agagaccNNNNNN------------NNNNNggtctcaGTTTATTGgRNATranscriptioninitiationsite(G)ofU6promoterBsaIBsaIpEasy-Blunt载体骨架2.2CRISPR双元载体(双子叶植物用，也可用于单子叶植物，但pYLCRISPR/Cas9-MT(I)更合适单子叶植物)3.基因组靶位点选择和双链接头设计3.1靶位点选择（1）在目标区如果能够找到NGG上游第20碱基是A（用U3启动子）或G(用U6启动子）的序列（(U3或U6启动子转录起始碱基），优先选为靶序列合成接头的形式（U3启动子右上，U6a启动子右下）注意：接头的2个粘性末端不互补(2)如果在NGG上游第20碱基不是A或G，可选20碱基为靶序列（KabinXieandYinongYang，2013，MolecularPlant)合成接头的形式（U6a启动子）为了提高突变效率，对一个目的基因设计多个靶点。建议在ORF5’区和中部区域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。5-NNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNN-3靶位点PAMG如果这里存在4碱基酶切位点，有利于检测打靶效果19nt5-ggcANNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’19nt正向接头引物反向互补接头引物5-gccGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’19nt5-gccGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-33-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-520nt5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNN-3PAM20ntP35SpCas9NLS(核定位信号）T35sAscIRBLBP35:HPTpVS1repliconNotIpBR322oripBR322bornKanrpYLCRISPR/Cas9-MT(II)(E.coliTOP10F’(LacIq)NotINotIBsaIBsaIccdBAscI5’-ctGCCGaGAGACCccdBGGTCTCAGTTTTA-3’B1BL’大肠杆菌致死基因几个靶位点设计例：左图：切点在起始密码附近或尽量在ORF上游，或在特定的功能域(可能引起密码子缺失和移码)右图：切点在外显子末端或前端（可能引起移码，或内含子识别位点缺失使内含子不被剪切）特异性检查：虽然对植物基因打靶的特异性不是重要的问题（万一有负面作用的脱靶发生，与原受体亲本杂交就可排除），但应该将候选靶序列+NGG（5’端加几十碱基）对目标基因组做Blast，避免在靶序列3’端+NGG与其它功能基因有高相似性。但是打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时，就选择几个目标基因完全相同的区域为靶位点。3.2靶位点接头设计例4.多靶点pYLCRISPR/cas9-MT(II)载体构建4.1gRNA表达盒构建示意图（三靶点为例）TTGCGAGCGAGATCGAGCGATGGCGACGGGG-3起始密码PAMCas9切点TAAGAGCATAAGAACGGCGTTAAAAGGGTATGATAATGCAGTATGGTTA-3内含子切点外显子5’-gcctacggccatggtaagtgcccccatcctcttctacccctttgattt-3’3’-ggtaccattcacgggggtaggag-5’ExonIntronborder20bpPAMggcAaggatgggggcacttaccatcctacccccgtgaatggtcaaa-5’-3’5’-3’-ForU3-gRNAgccGaggatgggggcacttaccatcctacccccgtgaatggtcaaa-5’-3’5’-3’--ForU6a-gRNAgttGaggatgggggcacttaccatcctacccccgtgaatggtcaaa-5’-3’5’-3’--ForU6b-gRNAtcaGaggatgggggcacttaccatcctacccccgtgaatggtcaaa-5’-3’5’-3’--ForU6c-gRNAU6gRNAU6gRNABsaIBsaIcleavageU6gRNATarget-1(T1)ligationPCRamplificationU6gRNABsaI(B1’)BsaI(B2)U6gRNAT1BsaI(B1’)(B2)U6gRNAT2BsaI(B2’)(B3)BsaIBsaIU6gRNAT3(TL)BsaI(B3’)(BL)BsaImixandBsaIcleavageBsaINote:stickendsB1’andBLarecomplementarytotheB1andBL’endsinpYLCRISPR/Cas9-MT(I)vector,respectively.为了提高接头连接效率，使用较高的接头浓度（0.05-0.1μM），这样主要是产生线性连接，而环状连接较少。但2种方式在随后的PCR中，都是通过上游片段正链和下游片段负链通过接头序列配对延伸而产生完整的目标片段4.2gRNA表达盒扩增引物ForT1：Ugccg-B1’:ATAAATTggtctcagccgTGGAATCGGCAGCAAAGG-3（U6启动子上游引物）gRctga-B2:ATAATTTggtctcttcagCCATCCACTCCAAGCTC-3(gRNA引物)ForT2:Uctga-B2’:ATAAATTggtctcactgaTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRaaga-B3:ATAATTTggtctcttcttCCATCCACTCCAAGCTC-3ForT3:Uaaga-B3’:ATAAATTggtctcaaagaTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRgact-B4:ATAATTTggtctctagtcCCATCCACTCCAAGCTC-3ForT4:Ugact-B4’:ATAAATTggtctcagactTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRgttt-BL:ATAATTTggtctctaaacCCATCCACTCCAAGCTC-34.3靶标gRNA表达盒排列目前只有1个U6启动子，该启动子在双元载体的多次重复排列可能在农杆菌发生重组变异。建议目前版本构建最多3-4个靶点。我们正在克隆更多的拟南芥U3/U6启动子，以方便做更多靶点的稳定载体.引物使用方法1个靶点：用引物对B1’/BL扩增相应的pU-T1-gRNAU6接头接头PCR加热过程中有缺口的引物先解离，长链立即延伸补平gRNA区线性连接环状连接U6延伸补平PCR扩增U6gRNA区U6上游引物缺口复性2个靶点：用引物对B1’/B2,B2’/BL扩增相应的pU-T1-gRNA,pU-T2-gRNA;3个靶点：用引物对B1’/B2,B2’/B3,B3’/BL扩增相应的pU-T1-gRNA,pU-T2-gRNA,pU-T3-gRNA;4个靶点：用引物对B1’/B2,B2’/B3,B3’/B4,B4’/BL扩增相应的pU-T1-gRNA,pU-T2-gRNA,pU-T3-gRNA,pU-T4-gRNA4.4靶标gRNA表达盒与pYLCRISPR/cas9-MT(II)的连接示意图5多靶点载体构建详细操作方法：1.接头合成：为了避免双链接头含有不完全长度分子。将接头引物TE溶解成100μM母液，各取1μl加入到98μl0.5xTE混合稀释到1μM。约90℃30S，移至室温冷却完成退火。2.gRNA载体酶切：取pU3-gRNA和pU6a~c-gRNA质粒各~500ng，在20μl反应用~0.25μl（5U)BsaI（NEB公司）酶切20min（不要过度酶切，过度酶切可能产生平滑末端和质粒自连接，而未切断质粒不影响后续反应），冷冻保存公用。3.gRNA表达盒连接反应：酶切过的pU6载体与所对应接头连接反应：1μl10xT4buffer；1μl(~25ng)pU3-gRNA（pU6a~c-gRNA）载体；0.5-1.0μl接头（最终浓度0.1-05μM)约35-70UT4DNAligase(0.1-0.2μl)加ddH2O至10μl室温连接约10-20min（延长连接时间不会明显提高效率）4.PCR扩增：取1-2μl连接产物为模板，25-50μlPCR(所有靶点的反应合计约100μl)按第9页选择引物对(0.2μM)KOD（或其它高保真酶）95℃1minBsaI(B1)BsaI(BL’)U6gRNATarget-1(B1’)(B2)U6gRNATarget-2(B2’)(B3)U6gRNATarget-3(B3’)(BL)LBRBLastBsaIsitepYLCRISPR/Cas9-MT(II)骨架HPTCas910循环：95℃15s，58℃15s，68℃15s（过长时间会使未切断的载体被扩增）15-20循环：95℃15s，68℃15s5μl电泳检查5.把所有要连接的U3-靶点-gDNA和U6a~c-靶点-gDNAPCR产物混合(最好直接加入0.5μl核酸酶（ExoI,Takara)消化单链引物），酚抽提-乙醇沉淀或PCR产物纯化kit纯化。6.所有产物在100μl反应用20UBsaI37℃酶切30min，75℃3min（使切出的12bp末端小片段变性，以减少连接竞争）。酚抽提乙醇沉淀或过柱纯化。（如果必要，取约100ng产物做连接，电泳检查是否能连成多聚体）7.取约2-3μgpYLCRISPR/Cas9-MT(II),在50μl（20UBsaI）酶切30min,用低熔点胶电泳回收酶切的质粒片段（去除ccdB片段）。用0.5xTE洗回收胶30分钟，65℃3min熔解，在40℃加入Agarase（1U/100μl)处理30分钟后，分装成每管50-80ng冷冻保存公用（一管做一次连接，以避免多次冻融）。8.在切好分装的pYLCRISPR/Cas9-MT(II)(约50-80ng）管中，加入相当于每种靶点PCR产物约10-15ng(如2种，共20-30ng，3种共约40-50ng，4种共约60-70ng,更多种时适当增加；这样载体与每种插入片段摩尔比=1:5-8)，在10μl连接反应（~70U连接酶）20度连接2-3h。透析