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©DKSH细胞外囊泡的表征细胞外囊泡的表征细胞外囊泡的表征细胞外囊泡的表征纳纳纳纳米颗粒追踪分析技术米颗粒追踪分析技术米颗粒追踪分析技术米颗粒追踪分析技术(NTA)德国德国德国德国ZetaView®©DKSHPage2Intraluminalvesicles(ILVs)(Johnstone1987)ExosomesMicrovesiclesEctosomes,Oncosomes,MicroparticlesThéryetal.2009VanderPool2012ExtracellularVesicles(ISEV)Apoptoticbodies外泌体微泡外泌体和微泡其他的名称凋亡小体统称细胞外囊泡©DKSHPage3Lotvall,Hilletal,JEV(2014)以各种含膜纳米颗粒名称发表的文章数量©DKSHPage4截止2017年6月在Pubmed上发表的Exosomes的文章数量统计©DKSHPage5截止2017年6月在Pubmed上发表extracellularvesicles的文章数量统计©DKSHPage65µm-15µm1µm-5µm100nm–1µm30–100nm细胞血小板细菌病毒凋亡小体微泡外泌体©DKSHPage7细胞外囊泡分离的常规方法差速离心密度梯度离心体积排除色谱法超滤免疫捕获沉降©DKSHPage8差速超速离心被认为是外泌体纯化的金标准，但是得到的产率较低©DKSHPage9细胞上清/尿液/唾液中外泌体分离的标准流程超速离心©DKSHPage10血浆/血清中外泌体分离的标准流程超速离心©DKSHPage11细胞上清，尿液和唾液中各种试剂盒分离外泌体的方法比较©DKSHPage12血清和血浆中各种试剂盒分离外泌体的方法比较©DKSH细胞外囊泡分析鉴定方法细胞外囊泡分析鉴定方法细胞外囊泡分析鉴定方法细胞外囊泡分析鉴定方法1#:WesternBlotting2#:NTA(纳米颗粒追踪分析)3#:TEM(透射电镜)©DKSH细胞外囊泡分析鉴定方法细胞外囊泡分析鉴定方法细胞外囊泡分析鉴定方法细胞外囊泡分析鉴定方法1#:WesternBlotting2#:NTA(纳米颗粒追踪分析)3#:TEM(透射电镜)©DKSHPage15各种颗粒分析方法各种颗粒分析方法各种颗粒分析方法各种颗粒分析方法–颗粒浓度要求的范围颗粒浓度要求的范围颗粒浓度要求的范围颗粒浓度要求的范围DLSNTAFC粒径大小/nm颗粒浓度，每毫升颗粒数©DKSHPage16细胞外囊泡目前的主要研究方向细胞外囊泡目前的主要研究方向细胞外囊泡目前的主要研究方向细胞外囊泡目前的主要研究方向•标准化•分离纯化方法•不同类型微泡的命名•寻找疾病生物标记物•将细胞外囊泡用于疾病治疗•生产GMP级别的细胞外囊泡•不同来源细胞外囊泡的生物功能研究•细胞外囊泡在细胞和组织中的染色成像©DKSH外泌体治疗外泌体治疗外泌体治疗外泌体治疗•用于包裹和运输药物的载体•自然生成•免疫惰性•保护内部包裹物•被目标细胞很容易接收•无内在毒性•包裹物多种多样:miRNA,mRNA,蛋白质(抗体),药物,siRNA©DKSHPage18RaghuKalluri教授教授教授教授将外泌体应用于癌症的早期诊断的想法是因为即使是癌症早期的患者，肿瘤也会在组织或血液中产生外泌体。由于这些外泌体来自于癌细胞，一旦将它们从血液或其它体液中分离出来，包含在其中关于癌细胞的信息能让我们了解到癌症是到了什么阶段了，是什么样的突变以及还能进一步分析其中蛋白、RNA的信息，这样能够让我们精确地确定诊断和治疗方案。外泌体分子标记物和肿瘤诊断©DKSHPage19国际细胞外囊泡协会主席和国际细胞外囊泡协会主席和国际细胞外囊泡协会主席和国际细胞外囊泡协会主席和PMX老板老板老板老板AndrewFrancisHill教授教授教授教授澳大利亚墨尔本拉筹伯大学分子科学学院生物化学与基因组学系主任。国际细胞囊泡大会(ISEV)现任主席。PMX公司老板：MargretBoeck（右一）Dr.HannoWachernig（左一）©DKSHPage202016.12.-2017.8参加过的学术会议和研讨会©DKSHPage21可视化可视化可视化可视化进样进样进样进样测量测量测量测量纳米颗粒追踪分析技术纳米颗粒追踪分析技术纳米颗粒追踪分析技术纳米颗粒追踪分析技术©DKSHPage22Zeta电位颗粒数量粒径大小悬浮的纳米颗粒自动聚焦自动聚焦自动聚焦自动聚焦样品池横截面数字化相机物镜激光器ZetaView内部结构示意图内部结构示意图内部结构示意图内部结构示意图荧光配套的滤光片©DKSHPage23参数参数参数参数相关物理性质相关物理性质相关物理性质相关物理性质举例举例举例举例粒径大小粒径范围和分布,颗粒团聚现象外泌体:30–170nm微泡的存在颗粒浓度剂量,动力学变化治疗前后细胞外囊泡浓度的变化Zeta电位(表面电荷)代谢纳米金颗粒在表面处理前后电荷的变化荧光生化鉴定抗体结合荧光标记©DKSHPage24ApplicationsofZetaView®乳液聚合物荧光标记生物纳米颗粒纳米金属颗粒纳米气泡量子点不规则纳米颗粒生物纳米颗粒脂质体+胶束药物运输蛋白质团聚病毒样颗粒(VLP)病毒样品细胞外囊泡(EV)©DKSHPage25布朗运动分析样品颗粒大小布朗运动分析样品颗粒大小布朗运动分析样品颗粒大小布朗运动分析样品颗粒大小•Stokes-Einstein方程•平均均方位移的时间间隔量化D=扩散系数x,y²=平均均方位移kB=Boltzmann常数T=温度η=粘度r=颗粒半径纳米金颗粒40nm∆y∆x•检测颗粒的位置©DKSHPage26ZetaView对对对对50个和个和个和个和1000个颗粒统计的结果比较个颗粒统计的结果比较个颗粒统计的结果比较个颗粒统计的结果比较Pos2Pos3Pos4Pos5Pos6Pos7Pos8Pos9Pos11Pos1002468100100200300400500Abs.numberperbinHydrodynamicdiameter(NTA)/nm0501001502000100200300400500Abs.numberperbinHydrodynamicdiameter(NTA)/nm0501001502000100200300400500Abs.numberperbinHydrodynamicdiameter(NTA)/nmPos1©DKSHPage27NTA扫描扫描扫描扫描•自动多位点扫描自动多位点扫描自动多位点扫描自动多位点扫描•样品结果更有代表性样品结果更有代表性样品结果更有代表性样品结果更有代表性•每分钟每分钟每分钟每分钟1000粒子粒子粒子粒子+异常值控制的有异常值控制的有异常值控制的有异常值控制的有效性分析效性分析效性分析效性分析激光器相机©DKSHPage28重现性测试重现性测试重现性测试重现性测试每次测试拆卸样品池，自动对光聚焦偏差偏差偏差偏差5%冲洗和自动对光冲洗和自动对光第一天第二天第1次测试第2次测试第3次测试©DKSHPage29通过颗粒计数计算样品浓度通过颗粒计数计算样品浓度通过颗粒计数计算样品浓度通过颗粒计数计算样品浓度相机激光单位点测量体积单位点测量体积单位点测量体积单位点测量体积~5nL线性相关线性相关线性相关线性相关©DKSHPage30100:150:120:110:1理论比值和粒径分布曲线理论比值和粒径分布曲线理论比值和粒径分布曲线理论比值和粒径分布曲线©DKSHPage31很一致10R520R推荐推荐推荐推荐1…10一个视频，一个SOP10…500两次稀释，两个SOPs500相机参数优化两个视频，两个SOPs100nm和和和和500nm颗粒人工混合颗粒人工混合颗粒人工混合颗粒人工混合©DKSHPage32光学结构比较光学结构比较光学结构比较光学结构比较10x20x放大倍数测量体积~1nL~5nL光学放大测量体积©DKSHPage33卵磷脂脂质体的表征卵磷脂脂质体的表征卵磷脂脂质体的表征卵磷脂脂质体的表征2.4·1013cm-36.2∙1013cm-3n500用水稀释200,000倍©DKSHPage34果汁中的纳米颗粒果汁中的纳米颗粒果汁中的纳米颗粒果汁中的纳米颗粒AuNP30nminorangefruitjuice低浓度低浓度低浓度低浓度（（（（金属金属金属金属））））纳米颗粒的检测纳米颗粒的检测纳米颗粒的检测纳米颗粒的检测©DKSHPage35什么是特异性检测什么是特异性检测什么是特异性检测什么是特异性检测?©DKSHPage36λexλem荧光物质颗粒，微泡，脂质体等抗体EVsfromHEK293cellline,ABwithAlexa488®荧光荧光荧光荧光NTA(F-NTA)©DKSHPage37荧光标样的粒径和颗粒浓度图荧光标样的粒径和颗粒浓度图荧光标样的粒径和颗粒浓度图荧光标样的粒径和颗粒浓度图表面带荧光表面带荧光表面带荧光表面带荧光探针的探针的探针的探针的40-1000nm的的的的颗粒颗粒颗粒颗粒40100200nm©DKSHPage38聚苯乙烯荧光标样聚苯乙烯荧光标样聚苯乙烯荧光标样聚苯乙烯荧光标样纯粹的聚苯乙烯荧光标样纯粹的聚苯乙烯荧光标样纯粹的聚苯乙烯荧光标样纯粹的聚苯乙烯荧光标样荧光聚苯乙烯和荧光聚苯乙烯和荧光聚苯乙烯和荧光聚苯乙烯和未标记聚苯乙烯未标记聚苯乙烯未标记聚苯乙烯未标记聚苯乙烯颗粒数颗粒数颗粒数颗粒数1:1散射模式散射模式散射模式散射模式荧光模式荧光模式荧光模式荧光模式对荧光标记和未标记的颗粒数量进行定量对荧光标记和未标记的颗粒数量进行定量对荧光标记和未标记的颗粒数量进行定量对荧光标记和未标记的颗粒数量进行定量©DKSHPage39定量百分比定量百分比定量百分比定量百分比*********************************荧光标记荧光标记荧光标记荧光标记****************©DKSHPage40荧光模式荧光模式荧光模式荧光模式nF比率nS/nF1:11,000:1100:110,000:1散射模式散射模式散射模式散射模式nS动态比值超过动态比值超过动态比值超过动态比值超过可以超过可以超过可以超过可以超过10,000:110000个未标记的颗粒中有一个带荧光标记的颗粒个未标记的颗粒中有一个带荧光标记的颗粒个未标记的颗粒中有一个带荧光标记的颗粒个未标记的颗粒中有一个带荧光标记的颗粒©DKSHPage41散射模式散射模式散射模式散射模式荧光模式荧光模式荧光模式荧光模式细胞外囊泡用细胞外囊泡用细胞外囊泡用细胞外囊泡用CMO染料染色染料染色染料染色染料染色(520|550)含膜颗粒含膜颗粒含膜颗粒含膜颗粒百分比百分比百分比百分比产率:85%****©DKSHPage42来自来自来自来自HEK293细胞的囊泡细胞的囊泡细胞的囊泡细胞的囊泡，，，，带带带带Alexa488®的抗体的抗体的抗体的抗体带荧光染料的抗体蛋白特异性标记带荧光染料的抗体蛋白特异性标记带荧光染料的抗体蛋白特异性标记带荧光染料的抗体蛋白特异性标记特异性结合的百分比1:1…..10,000:1©DKSHPage43带表面涂层的量子点带表面涂层的量子点带表面涂层的量子点带表面涂层的量子点激发光激发光激发光激发光488nm,激发的荧光激发的荧光激发的荧光激发的荧光605nm©DKSHPage44染料染料染料染料光稳定性光稳定性光稳定性光稳定性Alexa®Fluor+++Atto+++Fluoresbrite®YG+++Quantumdots(405or488)+++RhodamineB+DiO,DiL,CMO++PKH67+GFP+FITC--激光波长和荧光标记物激光波长和荧光标记物激光波长和荧光标记物激光波长和荧光标记物激光波长激光波长激光波长激光波长滤光片滤光片滤光片滤光片405nm430LP488nm500LP520nm550LP660nm680LP对于对于对于对于‘‘‘‘小