第五章-发酵条件及过程控制

第五章发酵条件及过程控制本章主要内容第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制第二节温度的影响及其控制第三节pH的影响及控制第四节溶氧的影响及控制第五节泡沫的影响及控制第六节二氧化碳和呼吸商第七节发酵终点的控制第八节发酵过程的控制本章主要内容第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制第二节温度的影响及其控制第三节pH的影响及控制第四节溶氧的影响及控制第五节泡沫的影响及控制第六节二氧化碳和呼吸商第七节发酵终点的控制第八节发酵过程的控制第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制（一）碳源1、碳源的种类的影响迟效碳源􀂄种类：淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油􀂄优点：不易产生分解产物阻遏效应；有利于延长次级代谢产物的分泌期􀂄缺点：溶解度低，发酵液粘度大。速效碳源种类：葡萄糖优点：吸收快，利用快，能迅速参加代谢合成菌体和产生能量缺点：有的分解代谢产物对产物的合成会产生阻遏作用。糖对青霉素生物合成的影响2、碳源的浓度影响发酵过程举例（1）碳分解代谢物阻遏：在某一浓度下碳源会阻遏一个或多负责产物合成的酶。克服该效应一种方法是采用中间补料的方式使补入碳源的速率等于其消耗速率；另一种方法是使用非阻遏性碳源。（2）过高浓度对菌体生长的影响：在重组毕赤酵母发酵生产水蛭素过程中，甲醇既作为碳骨架，使细胞生长，又作为诱导物可以提高产物表达，但甲醇浓度的提高会抑制细胞生长甚至导致细胞死亡。因此，利用甲醇传感器控制甲醇流量，同时以限制性速度混合流加甘油，可获得较高的水蛭素产量。（3）yeastCrabtreeeffect：即酵母生长在高糖浓度下，即使溶氧充足，它还会进行厌氧发酵，从葡萄糖生产乙醇。因此，一般采用补料分批或连续培养方式来避免crabtree效应。yeastCrabtreeeffectdescribesthephenomenonwherebytheyeast,Saccharomycescerevisiae,producesethanol(alcohol)aerobicallyinthepresenceofhighexternalglucoseconcentrationsratherthanproducingbiomassviathetricarboxylicacidcycle,theusualprocessoccurringaerobicallyinmostyeastse.g.Kluyveromycesspp.Increasingconcentrationsofglucoseacceleratesglycolysis(thebreakdownofglucose)whichresultsintheproductionofappreciableamountsofATPthroughsubstrate-levelphosphorylation.ThisreducestheneedofoxidativephosphorylationdonebytheTCAcycleviatheelectrontransportchainandthereforedecreasesoxygenconsumption.Thephenomenonisbelievedtohaveevolvedasacompetitionmechanism(duetotheantisepticnatureofethanol)aroundthetimewhenthefirstfruitsonEarthfellfromthetrees.HereisthedetailofyeastCrabtreeeffect（二）氮源1、氮源的种类☺无机氮源和有机氮源：发酵工业中常用的无机氮源包括硝酸盐、铵盐、氨水等；有机氮源包括豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母粉、酒糟、尿素等。☺无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源，反之为迟效氮源。前者包括氨基态氮的氨基酸或者铵盐形式的硫酸铵和玉米浆等，后者包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉等。☺速效氮源易于被菌体吸收利用，所以有利于菌体生长，却会影响某些产物的的产量；迟效氮源对延长次级代谢产物的分泌期、提高产物产量有好处，但一次性投入容易使养分过早耗竭，导致菌体过早衰老自溶，从而缩短产物分泌期。因此，发酵培养基一般选用含有速效迟效氮源的混合氮源。☺对某些发酵过程来说，培养基中某些氮源的添加有利于该发酵过程中产物的积累，这些主要是培养基中的有机氮源作为菌体生长繁殖的营养外，还有作为产物的前体。无机氮源利用会快于有机氮源，但是常会引pH值的变化，这必须注意随时调整。2、氮源的浓度☺氮源浓度过高，会导致细胞脱水死亡，且影响传质；浓度过低，菌体营养不足，影响产量。☺影响发酵的方向：谷氨酸发酵——NH4+供应不足,促使形成α-酮戊二酸；NH4+过量,促使谷氨酸转变成谷氨酰胺，所以要控制适量的NH4+浓度。☺为调节菌体生长和防止菌体衰老自溶，可根据需要随时补加有机和无机氮源。（三）磷酸盐浓度的影响及控制☺基础培养基中采用适量的浓度给予控制，以保证菌体的正常生长所需；代谢缓慢：补加磷酸盐。举例：在四环素发酵中,间歇,微量添加磷酸二氢钾,有利于提高四环素的产量。☺微生物生长良好时，所允许的磷酸盐浓度为0.32～300mmol/L，但次级代谢产物合成良好时所允许的磷酸盐最高水平浓度仅为1mmol/L。因此，在许多抗生素，如链霉素、新霉素、四环素、土霉素、金霉素和万古霉素等的合成中要以亚适量添加。举例：四环素发酵：菌体生长最适的磷浓度为65～70μg/mL,而四环素合成最适磷浓度为25～30μg/mL。（四）菌体浓度的影响及控制1、菌体浓度（cellconcentration）指单位体积中菌体的含量，是发酵工业中的一个重要参数。它不仅代表菌体细胞的多少，而且反应菌体细胞生理特性不完全相同的分化阶段。在发酵动力学研究中，常采用菌体浓度来计算菌体的比生长速率和产物的比生产速率等动力学参数及相互关系。•菌体浓度的检测浊度法：用于非丝状菌的浓度测定。通常测定420-600nm波长范围内的光密度值（OD）。吸光度要求控制在0.3-0.5。干重法：取一定体积的发酵液离心或过滤，105℃烘至恒重称重。离心称湿重法：取一定体积的发酵液离心或过滤，自然沉降或离心，测定湿重。2、影响菌体生长速率的因素：☻菌体生长速率与微生物的种类和自身的遗传特性相关；如：典型的细菌，酵母，霉菌和原生动物的倍增时间分别为45min，90min，3h和6h左右，这说明各类微生物增殖速率的差异。☻取决于营养物质的种类和浓度，基质浓度与比生长率的关系如右图所示。如：各种碳源和氮源等成分和它们的浓度。上限浓度，基质抑制(渗透压，关键酶，代谢废物)。一些营养物质的上限浓度(g/L)如下：葡萄糖100，NH4+5，PO43-10。☻有影响的环境条件有温度,pH值,渗透压和水分活度等因素。3、菌体浓度对产物的影响♦在适当的比生长速率下，发酵产物的产率与菌浓成正比关系,即P=QPmc(X)。式中，P——发酵产物的产率(产物最大生成速率或生率),g/(L·h);QPm——产物最大比生成速率,h-1;c(X)——菌体浓度,g/L.♦初级代谢产物的产率与菌体浓度成正比；♦而次级代谢产物的生产中，控制菌体的比生长速率μ比μ临略高一点的水平，即c(X)≤c(X)临时，菌体浓度越大，产物的产量才越大。♦c(X)过高，摄氧率增加，溶氧成为限制因素，使产量降低。控制接种量：接种量指种子液体积和培养液体积之比。一般发酵常用接种量5%～10%；抗生素的接种量有时可增至20%～25%，甚至更大。基质含量：营养的配比和中间补料的方式。生长速率取决于基质的浓度，在微生物发酵的研究和控制中，营养条件（含溶氧）的控制至关重要，主要受基质浓度的影响，所以要依靠调节培养基的浓度来控制菌浓。4、发酵中菌体浓度的控制为了获得抗生素最高的生产率，需要采用摄氧速率OUR与传氧速率OTR相平衡时的菌体浓度，也就是传氧速率随菌浓变化的曲线和摄氧速率随菌浓变化的曲线的交点所对应的菌体浓度，即临界菌体浓度c(X)临。本章主要内容第一节营养基质和菌体浓度的影响及控制第二节温度的影响及其控制第三节pH的影响及控制第四节溶氧的影响及控制第五节泡沫的影响及控制第六节二氧化碳和呼吸商第七节发酵终点的控制第八节发酵过程的控制第二节温度对发酵的影响及控制☻微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境。☻通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快一倍，温度直接影响其生长。机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。☻微生物可生长的温度范围较广，总体说在-10～95℃。1、温度对发酵的影响（1）温度对微生物生长的影响大多数微生物在20-40℃的温度范围内生长。嗜冷菌在温度低于20℃下生长速率最大，嗜中温菌在30-35℃左右生长，嗜热菌在50℃以上生长。（2）温度对发酵过程的影响温度对青霉菌生长速率、呼吸强度和青霉素生产速率的影响如上图所示。可以看出，温度对参与生长繁殖、呼吸和青霉素形成的速率影响是不同的。温度对青霉菌生长速率的影响温度对青霉菌呼吸强度的影响温度对青霉素生产速率的影响温度对青霉菌生长速率的影响温度对青霉菌呼吸强度的影响温度对青霉素生产速率的影响（3）温度对发酵液物理性质的影响＃影响氧在发酵液中的溶解度温度↑溶氧↓＃影响基质的分解和吸收速率如：菌体对硫酸盐吸收在25℃时最小。（4）温度对生物合成方向的影响金色链霉菌►四环素发酵中所用的金色链霉菌，其发酵过程中能产生金霉素和四环素。►低于30℃时，合成金霉素能力强，合成四环素能力随温度升高而增加；当达到35℃时，只产生四环素。（5）温度对微生物代谢调节的影响◊温度与微生物的代谢调节机制关系密切例如：在低温（20℃）时，氨基酸末端产物对其合成途径的第一个酶的反馈抑制作用，比在其正常生长温度37℃时更大。因此，考虑在抗生素发酵的后期降低温度，加强氨基酸的反馈抑制作用，使蛋白质和核酸的正常合成途径关闭得早些，从而使发酵代谢转向抗生素的合成。◊微生物的酶的组成和特性也受到温度的控制例如：用米曲霉制曲时，温度控制在低限，有利于蛋白酶的合成，α-淀粉酶的活性受到抑制。2、影响发酵温度的因素•发酵热：指的是发酵过程中释放出来的净热量，以J/(m3·h)为单位表示。•发酵热的通式可表示为：Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发±Q辐射（1）生物热（Q生物）：指微生物在生长繁殖中，培养基质中的碳水化合物、脂肪和蛋白质被氧化分解为二氧化碳、水和其他物质时释放出的热。这些释放出来的能量一部分用于合成和代谢活动，另一部分用于合成代谢产物，其余部分则以热的形式散失。►发酵过程中的生物热与菌株和培养基成分相关，菌种在营养丰富的培养基中因代谢活力较强，所以生物热要高于在营养一般的培养基中；在呼吸作用和发酵作用较强的对数生长期，所产生的热量要高于发酵初期的延滞期和发酵后期的衰亡期。（2）搅拌热（Q搅拌）：指在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间、液体与搅拌器等设备之间的摩擦而产生的热。搅拌热与搅拌轴的功率有关，计算公式为：Q搅拌=P×3601(kJ/h)式中，P——搅拌功率，kW；3601——机械能转变为热能的热功当量，kJ/(kW•h)。（3）蒸发热（Q蒸发）：指发酵过程中通气时，引起发酵液水分的蒸发，被空气和水分带走的热量，也叫汽化热。这部分热量在发酵过程中先以蒸汽形式散发到发酵罐的液面，再由排气管带走。可按下式计算：Q蒸发=qm（H出-H进）式中，qm——干空气的质量流量，kg/h；H出、H进——发酵罐排气、进气的热焓，kg/h。（4）辐射热（Q辐射）：指由于发酵罐液体温度与罐外环境温度不同，发酵液中部分热向外辐射或由外界向发酵液辐射所产生的热。辐射热的大小取决于罐内外温度差。（5）发酵热（Q发酵）►发酵热的计算：①通过测量一定时间内冷却水的流量和冷却水进出口温度来计算：Q