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防腐剂的测定概论薄层层析法苯甲酸、山梨酸测定防腐剂是指能防止食品腐败、变质，抑制食品中微生物繁殖，延长食品保存期的物质，它是人类使用最悠久、最广泛的食品添加剂。防腐剂的种类我国允许使用的品种主要有：苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、对羟基苯甲酸乙酯和丙酯、丙酸钠、丙酸钙、脱氢乙酸等。非允许的防腐剂：硼砂、水杨酸、氯霉素、青霉素防腐剂的测定方法GB/T5009·29—2003第一法气相色谱法第二法高效液相色谱法第三法薄层色谱法本标准规定了酱油、水果汁、果酱等食品中苯甲酸、山梨酸含量的测定方法。本标准适用于酱油、水果汁、果酱等食品中苯甲酸、山梨酸含量的测定。教学重点、难点薄层层析法薄层色谱法测定苯甲酸和山梨酸原理利用样品中各组分对吸附剂吸附能力的不同，发生了无数次吸附和解吸过程。对吸附剂吸附能力弱、对展开剂溶解度大的组分随流动相迅速向前移动，可较快地随着展开剂迁移到层析板的上端；对吸附剂吸附能力强的组分移动慢，则留在层析板的下端。利用各组分在展开剂中溶解能力和被解吸能力的不同，最终将各组分彼此分开。实验流程制板→活化→点样→展开→定性或定量1、制板――吸附剂均匀地涂在玻璃板上作为固定相，经干燥、活化后，称薄层板。将吸附剂均匀地涂在玻璃板上这个过程称制板。2、点样――把含有不同组成的被测样品，点在涂有吸附剂的薄层板上，称点样。3、展开――由于物质中各组分受到吸附剂的吸附力和溶剂的解吸附力的反复作用，各组分在层析板上向前迁移过程称为展开，选用适当的有机溶剂，通过毛细管作用，逐步浸润层析板，有机溶剂称为展开剂（流动相）。定性或定量展开后使各组分分离，再根据比移值和斑点的大小进行定性或定量。吸附剂分离效果及层析速度主要取决一吸附剂的粒度的大小。而吸附作用则与颗粒本身的微孔大小有关。吸附剂的活性：对于同一吸附剂，若以不同的方法制备处理，其吸附能力也有强弱的变化，一般常以“活性”表示吸附力的强弱。分为五级：一级活性最强，五级活性最弱。一般用二－三级。吸附剂的常用种类有：硅胶、聚酰胺薄层板制备1、平铺法：用购置或自制的薄层涂布器，进行制板，涂层既方便又均匀，是科研中常用的方法。2、倾注法：将调好的浆料倒在玻璃板上，用手摇晃，使其表面均匀平整，然后放在水平的平板上晾干。这种制板方法厚度不易控制。注意事项⑴用湿法制薄层，应入在水平的台面上，否则由于台面不平而使吸附剂糊状体向低处流动，造成薄层厚度不一致。⑵晾干时应放在通风良好的地方，无灰尘，以防薄层被污染。⑶烘干后应放在干燥器中冷却、贮存。活化活化的目的：是为了增加吸食剂的吸附能力，即增加活性。操作：湿法制板都应进行晾干、烘干干燥。薄层板经过自然干燥后，失去了大部分水分才能进行活化处理。活化的温度为105-110℃。观察与思考：将含水分过多的薄层板立即放入烘箱（105-110℃）中活化，会出现什么现象？由于水分突然大量蒸发则造成板面断裂或龟裂，而使薄层板不能使用。点样点样技术直接影响到分离效果和要检出灵敏度。点样仪器：玻璃毛细管（一般用于定性）、生化用血色素管（一般用于定性），微量注射器（一般用于定量），规格：20×20cm在薄板一端1.5厘米处开始每隔２厘米作一记号（铅笔轻轻点一下，切勿刺破薄层）共六点，用0.5毫米直径的毛细管吸取样品，各样品按右图点样二次（样品量５－５０微克，点子直径不超过２毫米）。薄层色谱法原理样品酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸。将样品提取液浓缩，点于聚酰胺薄层板上，展开。显色后，根据薄层板上苯甲酸、山梨酸的比移值，与标准比较定性，并可进行概略定量。展开展层至溶剂前沿顶端0.5～１厘米处时取出薄板（展开时间约１小时），在溶剂前沿处作记号并放在空气中晾干，以除去溶剂。将选择的展开剂倒入层析槽或层析缸中（液层高度约为0.5cm）,待容器内溶剂蒸气达到饱和后，将点好样的薄层析放入槽或缸中进行展开。（注意：点样的位置必须要在展开剂液面之上。）当展开剂展开，其前沿上升到板顶端5-10mm处时，取出薄层板，用铅笔划出前沿的位置、晾干。显色用喷雾器显色均匀喷雾在薄层上，放烘箱中保持８５℃加温至层析斑点显现。此显色剂可使各种糖呈现出不同颜色。定性根据各标准糖液层析后所得班点的位置确定混合样品中所分离出的各个斑点分别为何种糖。定量用各种显色方法使斑点出现后，应立即用铅笔或小针划出斑点的位置，并计算R值。化合物移动的距离（斑点中心到原点的距离）R值＝─────────────────────溶剂的移动的距离（溶剂前沿到原点距离）苯甲酸和山梨酸测定（薄层层析法）步骤样品处理→点样→展开→显色→定性或半→定量聚酰胺板的制备称取1.6g聚酰胺粉，加0.4g可溶性淀粉，加约7ml水，研磨3~5min，立即倒入涂布器内制成、0.3mm的薄层板两块，室温干燥后，于80℃干燥1h,取出置于干燥器中保存。注意事项：聚酰胺薄层板，烘干温度不能高于80℃，否则聚酰胺变色。注意！样品提取操作流程图：2.5g样品→于25ml具塞量筒→加0.5ml盐酸→用15ml乙醚萃取，振摇1min→用10ml乙醚萃取→合并两次萃取液→于另一25ml具塞量筒。思考题：酸化的目的是什么？使苯甲酸钠、山梨酸钾转变为苯甲酸或山梨酸，用乙醚提取。????另一25ml具塞量筒→NaCl洗涤两次→静止10min→通过无水NaSO4层过滤→于25ml容量瓶→加乙醚定容至25ml。吸取10.0ml乙醚提取液→分现将置于10ml具塞离心管中→40水浴上挥干→加0.1ml乙醇溶解残渣→备用。思考题1、样品中如含有二氧化碳、酒精时应如何处理？2、富含脂肪和蛋白质的样品应如何处理？答：如含有二氧化碳、酒精时应先加热除去；富含脂肪和蛋白质的样品应除去脂肪和蛋白质，以防用乙醚萃取时发生乳化。除去的方法同糖精的测定。????测定点样：在薄层下端2cm的基线上，用微量注射器点样品液，同时各点苯甲酸、山梨酸标准溶液。展开与显色：将点样后的薄层板放入预先盛有展开剂的展开内，展开槽周围贴有滤纸，待溶剂前沿上展至10cm，取出挥干，喷显色剂，斑点成黄色，背景为蓝色。样品中所含苯甲酸、山梨酸的量与标准斑点比较定量（苯甲酸、山梨酸的比移值依次为）。操作技术要点点样：少量多次，大小要均匀。展开：展开剂倒入展开槽中，展开剂液层约为.0.5cm,并盖盖一段时间，使之预告达到饱和状态，再放入薄层板。显色：均匀喷洒显色剂。计算X=m5×1000M6×10/25×V6/V5×1000