第十章-基因工程菌发酵

第十章基因工程菌的发酵基因工程是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。基因工程基因工程的核心技术是DNA的重组技术。除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。基因工程一般分为4个步骤：取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；把重组DNA引人某种细胞；把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。工程菌的获得确定目的产物，找出产该产物的细胞。将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNA分子。将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。工程菌具备的条件发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。菌株不是致病株，也不产内毒素。代谢控制容易进行。能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。基因工程菌发酵动力学基因工程菌发酵设备基因工程菌的高密度发酵和控制基因工程菌发酵的后处理技术基因工程菌的不稳定性及对策应用案例与分析基因工程菌发酵动力学基因工程菌发酵动力学模型分类基因工程菌培养过程的动力学模型理想情况：把细胞群体处理为一种溶质不考虑细胞结构，但各种细胞均一细胞之间不均一细胞内部多组分细胞之间无差异细胞内部多组分均衡生长均衡生长非结构模型结构模型平均细胞近似平均细胞近似非离散模型离散模型非离散、非结构模型（均衡生长模型）假设培养体系是均一的，忽略细胞间的差异和不同时期组成及代谢特性的差异适于研究细胞群体代谢生长代谢规律离散非结构模型培养体系中的细胞被区分成许多不同的状态和功能类型，对培养过程中细胞存在明显差异的系统是适合的。结构非离散模型细胞被分散成多个不同功能的部分，各部分相互协调作用，对分析胞内代谢调控有应用价值。离散结构模型细胞培养过程的实际情况，模拟单个细胞内的生化反应体系，通过单细胞模型的不同组合建立高层次的离散结构模型1基因工程菌细胞的生长动力学模型以对数生长期为例,处于该时期的微生物生长的数学模型如下：其中为细胞数量为培养时间拜为比生长速率10.1.2基因工程菌培养过程中的动力学模型由上式可以推导出可用以推算在间歇发酵中f值随世代数n的变化情况,这在基因工程菌株的发酵中是非常重要的参数,例如,假设从斜面培养到33000L发酵培养需要25代时间,25代后含质粒细胞还占多少,即f25为多少就是一个必需考虑到的问题。分析结果表明f值随p和的增大而减小。2外源基因的表达和控制机制提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。1）可诱导性启动子在构建表达载体时，可使用可诱导性的启动子，如：lac、trp、PL等在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选择培养条件使启动子受阻遏（抑制）到一定时期；然后去阻遏（诱导）使质粒高效表达。例如：利用3--吲哚乙酸可使trp启动子去阻遏2）温度敏感型质粒一些温度敏感型质粒在温度较低时质粒拷贝数较少，当温度升高到一定值时质粒大量扩增——脱缰质粒（runawayplasmid）如：pKN410在30℃时的拷贝数为20～50/E.coli细胞；在35℃时质粒大量复制。将-内酰氨酶基因接在其上，经热诱导后，酶活可扩增400倍。质粒的行为规律与宿主、质粒本身外界环境等密切相关工程菌培养过程中会发现质粒丢失现象，严重影响外源基因产物的产量和质量3质粒的行为规律原因分配的不稳定性结构不稳定性质粒不同拷贝状态分配不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。结构性不稳定：由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。质粒保持率为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率Fn的概念，Fn表示分批培养中细胞分裂n次后，培养液中基因工程细胞数与总细胞数的比值，即表达效率及质粒拷贝数控制在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。质粒行为动力学模型的建立意义控制质粒的稳定性确定质粒的复制速率表达产物合成条件10.2基因工程菌发酵设备机械搅拌发酵罐气升式发酵罐利用机械搅拌作用，使空气和搅拌液充分混合，促进氧的溶解和传递，满足微生物生长代谢对溶氧的需求原理：无菌压缩空气作为液体的提升力，使发酵液上下翻动实现混合和传质传热过程。优点：无机械搅拌机构最大限度的减少了染菌率，减少了机械剪切力，对长菌丝的各种真菌尤为适宜气体提升充分的气液混合使氧气的传递利用极大提高，特别适合高粘度培养基和对于溶氧要求高的产品。内循环发酵罐的结构材料的稳定性要好，一般要应用不锈钢制成罐体表面光滑易清洗，灭菌时没有死角与发酵罐连接的阀门要用膜式阀，不用球形阀所有的连接接口均要用密封圈封闭，不留“死腔”，不得有泄漏搅拌器转速和通气应适当空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料培养液要经化学处理或热处理后才可排放发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。轴封可采用磁力搅拌或双端面密封基因工程菌的培养设备10.3工程菌的高密度培养1、高密度培养（Highcell-densityculture;HCDC）——一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。基因工程菌广泛采用高密度培养技术2、限制高密度的主要因素1）营养成分2）抑制与阻遏3）溶氧水平4）有毒代谢物3、基因工程菌的高密度发酵和控制培养基的选择培养方式的选择溶解氧的控制温度的影响及控制PH的影响及控制基因工程菌的发酵工艺中菌体的增殖和产物的表达均在对数期完成改进：延长对数期的生长时间、缩短衰亡时间高密度发酵工艺（1）培养基的选择发酵特点：工程菌在短时间内迅速分裂增殖，菌体密度迅速升高培养基影响：高浓度的碳源、氮源和无机盐造成溶液的渗透压过高，导致细胞脱水，抑制菌体生长，目的产物得率下降大量产生乙醇，抑制菌体浓度的进一步升高多采用分批补料培养，各种培养基浓度低于抑制浓度成分的选择选择容易被工程菌利用的营养物质浓度的选择浓度比普通培养基高2-3倍，但不能太高，会使发酵液渗透压增加，不利于工程菌的生长基因工程菌发酵的基本操作方式有：分批培养分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限半连续培养（补料分批）在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的生长，或得到更多的代谢产物连续培养不断地流加营养，并不断地取出发酵液。连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。透析培养固定化培养(2)基因工程菌培养方式补料分批培养方式的选择补料分批培养方法葡萄糖浓度反馈控制流加恒速流加指数流加发酵-透析藕合技术：将发酵液用透析膜与透析液隔开，随着培养的进行，菌体形成的小分子代谢产物通过透析膜进入透析液，从而降低了在发酵液中的浓度，有利于解除产物抑制。如果在透析液中加入营养物质，则营养物质可反方向进入发酵液，供菌体利用（起到补料作用）。发酵罐透析罐透析膜发酵与透析藕合固定化培养固定化培养是通过化学或物理方法，将游离细胞或酶固定于限定的空间区域内，使其保持活性并可以反复利用，具有菌体密度高反应速度快发酵周期短产物分离简单反应过程控制容易菌体可重复连续使用和增加发酵过程中重组质粒稳定性的优点.基因工程菌的培养方式与固定化酶的制备方法大体相同；常用的有吸附法、包埋法、共价结合法、交联法、多孔物质包络法、超过滤法等，其中包埋法最为普遍。（3）溶解氧的控制基因工程菌发酵过程中，溶氧浓度()的高低影响菌体生长乙酸生成和外源质粒丢失，从而对外源蛋白的产量产生影响。措施：增大搅拌转速和空气流量方法：提高通气中氧的分压在菌体中克隆具有提高氧传质能力VHb蛋白（4）温度的影响及控制温度对工程菌发酵的影响体现在多个方面，如影响发酵基质的理化性质，工程菌的生长及代谢调控，目标产物的生成等一般情况下，工程菌菌体生长最适温度较高，而外源蛋白表达温度要低，因此工程菌发酵分为菌体生长阶段和外源基因蛋白表达阶段（5）PH的影响及控制发酵过程中，菌体代谢产生CO2乙酸乳酸等产物不断积累，引起发酵基质pH值的改变.pH值的变化，影响菌体内H﹢或OH-离子的浓度，进而影响酶蛋白的解离度，引起酶的活性改变，因此对菌体生长目标蛋白表达和活性等具有非常明显的影响菌体生长和产物合成的PH控制在6.8-7.6较高的PH对产物的产量有促进作用基因工程菌发酵的后处理技术细胞破碎蛋白质的浓缩与分离纯化核酸的分离纯化酚/氯仿抽提酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意10.5基因工程菌的不稳定性及对策不稳定的表现不稳定的原因及对策质粒不稳定性表达产物的不稳定性1质粒不稳定的表现基因工程菌的不稳定包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定个方面。具体表现为下列种形式：质粒的丢失，重组质粒发生、片段脱落，表达产物不稳定。质粒的丢失：由于某种环境因素或生理、遗传学上的原因,质粒从某些宿主细胞中丢失,因此工程菌的发酵过程实际上是种菌的混合。重组质粒发生、片段脱落：有时质粒不稳定并非由于质粒丢失,而是重组质粒上一部分片段脱落,表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。产物不稳定也是一个很重要的问题。2质粒不稳定的原因重组质粒引入宿主后,引起宿主细胞和重组质粒之间的相互作用,在一定的环境中,其结果是在重组质粒上表达或不表达,重组质粒遗传稳定或不稳定。因此一个组建成的工程菌的稳定与否,取决于重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件个方面就质粒本身的分子结构而言,引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响，如果质粒在重组过程中影响到这些序列的完整性,其稳定性也受到影响另外可能由于重组质粒上有重复序列,或与宿主染色体有部分同源等都会造成质粒的不稳定。环境条件方面的原因培养基的组成组分通过各种途径影响稳定遗传培养温度低温有利于稳定遗传菌体比生长速率通过分解代谢物效应控制菌体的比生长速率，提高重组质粒的稳定性环境条件方面的原因在培养环境中高温（如42℃以上）、去垢剂（如SDS)、某些药物（如利福平）、染料（如丫啶类）、饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失，因此常需采取一些措施以防止或降低工程菌的不稳定性。1、组建合适载体常用质粒pBR322和pUB110在相应的宿主中很稳定，如二者组成穿梭质粒或与外源片段进行重组后，常出现不稳定现象。pC194是枯草杆菌中的一个常用质粒，亦较稳定，但在其HindIII切口处插入一段DNA