杀菌率试验规程

Q/KM—ZJ——2008液体洗涤剂杀菌试验规程（内部使用）2008年月日内部执行质量管理中心实验室引用标准1、GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准2、QB/T2738-2005日化产品抗菌抑菌效果的评价方法3、QB/T2850-2007抗菌抑菌型洗涤剂4、2002年版《消毒技术规范》(中华人民共和国卫生部)5、2001年版《药品微生物学检验手册》（科技出版社）杀菌率试验规程1、试验菌、试验温度、作用时间、试液浓度试验菌种：金黄色葡萄球菌（ATCC6538），大肠杆菌（8099或ATCC25922），白色念珠菌。试验温度：20℃±1℃。作用时间：最短不得小于30s。常规作用时间为2min、5min、10min、20min。试液浓度：中和剂鉴定用试液浓度应为正式杀菌试验最高浓度。菌悬液用量：正式杀菌试验用菌悬液的浓度、取量应与中和剂鉴定中1组、2组所用菌悬液的浓度、取量相同。2、细菌繁殖体悬液、菌片的制备程序：2.1菌悬液的制备⑴取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。取含5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物（放在4℃左右冰箱中保藏。每隔2-3个月移种一次，继续保藏。）。⑵取第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h～24h培养），用5.0ml吸管吸取3.0ml-5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，在手掌上振敲80次（力度适中，勿溅出），以使细菌悬液均匀。或从新鲜菌种斜面沾取少量菌苔，接种在适合试验菌生长的培养基中，37℃培养18h～24h（或适宜时间）。作为原菌液。（源于《药品微生物学检验手册》211页）⑶细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱备用。尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。应当天使用不得过夜。44回收菌数为1×10～9×10cfu/ml用PBS液配置GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》回收菌数为1×108—5×108cfu/ml用TSB营养肉汤配置—2002《消毒技术规范》2.2、菌片的制备程序：《消毒技术规范》⑴取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。取含5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。⑵取第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h～24h培养），用5.0ml吸管吸取3.0ml-5.0mlTSB营养肉汤加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，在手掌上振敲80次，以使细菌悬液均匀，含菌量1×108—5×108cfu/ml。⑶用无菌镊子夹住已灭菌10mm*10mm滤纸一角，一面朝上，注入10ul菌悬液，放到无菌平板内，37℃温箱中干燥20min-30min，（或在室温自然阴干后使用）制成菌片。每个菌片回收菌落，按活菌培养计数所得结果，应为5×105—5×106cfu/片。）⑷细菌繁殖体悬液和菌片，用毕应随时保存在4℃冰箱内。尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。（应当天使用不得过夜。）3、操作程序3.1、悬液定量法杀菌试验操作程序⑴、样品用无菌标准硬水稀释至同中和剂鉴定用试液浓度，或低于中和剂鉴定用试液浓度，制成（稀释液）试验样液。⑵、将试管按需要数量分别排列于试管架上，各组由左向右，排序、标记。44⑶、配制菌悬液，浓度为1×10～9×10cfu/ml—GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》或188×10—5×10cfu/ml—2002《消毒技术规范》⑷、取杀菌试验用无菌大试管，先加入0.5ml试验用菌悬液，再加入0.5ml有机干扰物质，混匀，置20±1℃5min，用无菌吸管吸取步骤1中的试验样液4.0ml注入其中，立即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇80次）。-见《消毒技术规范》或吸取试验用菌悬液0.1ml，加入到含5ml样液的试管中，立即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇80次）。-见QB/T2738-2005⑸、作用2min、5min、10min、20min，即刻用无菌吸管吸取0.5ml移入鉴定合格的4.5ml中和剂溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀，中和作用10min后，取样液、10倍系列稀释液0.5ml（见GB15979-2002）或分别吸取1.0ml（-见《消毒技术规范》）（见图四），置于2个灭菌平皿，用凉至40～45℃营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35℃±2℃培养48h（细菌）或（酵母菌）25℃±2℃培养72h，作活菌菌落计数。⑹、同时用稀释液代替样液进行平行试验，作为阳性对照管。⑺、阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。⑻、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。⑼、试验重复3次，求其平均值。根据各组活菌浓度（cfu/ml），计算杀菌率，见计算公式1。或根据各组活菌浓度换算为对数值（N），计算杀灭对数值，见计算公式2。3.2载体法杀菌试验操作程序⑴、试验样品用无菌标准硬水（过滤除菌）稀释至规定浓度，制成（稀释液）试验样液。⑵、吸取样液5.0ml放入灭菌平皿，另吸取PBS5.0ml注入平皿中，作为阳性对照皿。每皿用无菌镊子夹住菌片一角放入试样皿和阳性对照皿。⑶、作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片一角，投入含5.0ml中和剂的试管中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀计时。(见图三)⑷、中和10min后，取样液或10倍系列稀释液1.0ml（（见图四），置于两个灭菌平皿，接种凉至40～45℃营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml，转动平皿10-20下，使其充分均匀，凝固后，于35℃±2℃培养48h（细菌）或72h（酵母菌），作活菌菌落计数。⑸、试验重复3次，求其平均值。⑹、阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。A、PBC液（0.03mol/L磷酸盐缓冲液）、B、无菌标准硬水1ml置于灭菌平皿内、C、空白平皿，倾注营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml培养。⑺、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。4、计算公式1、杀菌率X1＝（A－B）/A×100%式中：X1—杀菌率（%）；A--对照样品平均菌落数；B--被试样品平均菌落数。2、杀灭对数值（KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度的对数值（Nx）备注：计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数，小于等于1时，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。5、评价标准杀菌率≥90%，产品有杀菌作用。悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值≥5.00，可判定为消毒合格。6、操作要点：（消毒技术规范2002版）1、对接触消毒剂（杀菌剂）的样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）；2、即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；3、在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物接触过久。审核：编制：中和剂悬液定量鉴定试验操作程序引用标准：QB/T2738-2005日化产品抗菌抑菌效果的评价方法（试验菌悬液在1×104—9×104cfu/ml）4—9×104GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准（试验菌悬液在1×107—5×107cfu/ml）2002消毒技术规范（试验菌悬液在1×10一、定义和术语cfu/ml）中和剂—在微生物杀灭试验中，试验微生物与杀菌剂作用达到规定时间的终点时，用以中和残留的杀菌剂，使其不在持续抑制和杀灭微生物的试剂。中和产物—中和剂加杀菌剂（样品）=9：1，作用10min配置而成。二、中和剂鉴定试验原理中和剂鉴定试验原理试验分组第1组杀菌剂＋菌液→培养第2组（杀菌剂＋菌液）＋中和剂第3组中和剂＋菌液→培养第4组（杀菌剂＋中和剂）＋菌液第5组阳性菌数对照第6组阴性对照。→培养→培养观察杀菌剂对观察残留杀菌观察中和剂是观察中和产阳性对照组。阴性对照组。试验菌有无杀剂被中和后，否抑菌。物，或未被完灭或抑制能力受到杀菌剂作全中和的残留试验目的用后的试验菌杀菌剂对试验是否能恢复生菌的生长繁殖长。是否有影响。三、中和剂鉴定试验中易出现的问题及解决方法出现的问题解决方法1①、②组无菌生长或②组平板上少于5个菌落，其它组正常。降低消毒剂浓度或缩短作用时间。2①②菌落数较多且数量基本相同，其它组正常。提高消毒剂浓度或延长作用时间。3③组中和剂菌落数明显少于PBS组菌数降低中和剂浓度或改变中和剂成分。4④组（中和产物）菌落数明显少于PBS组菌数，其它组正常。提高中和剂浓度或改变中和剂成分。5多次更换中和剂均不能得到满意结果。选用载体法进行中和剂鉴定，杀菌试验同时用载体法进行。四、1鉴定试验操作程序中和剂悬液定量鉴定试验操作程序-《消毒技术规范》试验分组第1组第2组第3组第4组第5组第6组取试验样品4.0ml加入各对应组取4.5ml中和剂加入对应组取4.9ml中和产物b加入对应组取4.5mlPBS—（稀释液）加入对应组20℃±1℃恒温5min菌悬液1.0ml菌悬液1.0ml0.1ml菌悬液＋0.4ml硬水混匀0.1ml菌悬液0.1ml菌悬液—＋0.4ml硬水混匀振敲80次，混匀作用至试验预定时间，取0.5ml加入下列对应组作用10min，—取0.5ml加入下列各对应组PBS4.5ml中和剂4.5ml中和剂4.5ml中和产物4.5mlPBS—4.5ml振敲80次、混匀/作用10min/—取适宜稀释度悬液1.0ml接种平板（2个/样本）活菌培养计数活菌培养计数用中和剂10倍系列稀释用中和产物10倍系列稀释用稀释液10倍系列稀释PBS＋中和剂各1.0ml接种平板cfu/ml）第1组不长第2组菌数第3、4、5组菌数相似，第6组无菌中和剂鉴定评价规定菌或明显少于第2组大于5且明显少于第3、4、5组误差率≤15%生长三组间平均菌数=（第3+4+5组菌数）÷3；误差率%=（三组平均菌数-各组菌落平均数）中和剂鉴定合格标准中对1、2组菌数要求。0＞5X（1-10）＞(X＋5)Y(＞10)＞1.5Y的绝对值之和/3×三组间平均菌数×100符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中结论和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。a菌悬液浓度及制备：消毒技术规范用PBS（试验菌悬液在1×107—5×107备注b中和产物的配置：先将试验样液1.0ml与中和剂溶液9ml混合，作用10min后制成四、2鉴定试验操作程序中和剂鉴定试验操作程序-载体法试验分组用无菌镊子取菌片加入下列第1组吸取试验样品5.0ml第2组吸取试验样品5.0ml于无菌平第3组吸取中和剂5.0ml于无菌第4组吸取中和产物5.0ml于