荧光定量PCR引物设计要求

荧光定量PCR引物设计要求荧光定量PCR引物的具体设计要求：1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment软件看看结果。2.产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)。3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。4.G+C含量在40%~60%之间，45-55%最佳。5.碱基要随机分布，尽量均匀。6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。8.引物5′端可以修饰。9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GCrich的区域，避开T/C,A/G连续结构(2-3个)。10.引物3′端要避开密码子的第3位。11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo6软件进行比对看结果的情况。12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。16.TM值在58-62度之间。17.引物设计的软件Primer5.0有专门针对荧光的。ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'5'GACCACAAAGTCAGCCCCAG3'ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'5'CAACAGTCTTTTGAGTGGCAG3'5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'5'GCACAGTTGTCATAAGACCCTCAAC3'5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'5'GACCCTCAACAATGCCAAACC3'5'CAACGAGAAGGAATACACACC3'5'ACCCTCAACAATGCCAAAC3'TKGAPDH内参qRT-PCR引物的设计如下：1.119bpATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAGTKGAPDH-qF5'GTCAACGAGAAGGAATACACACC3'TKGAPDH-qR5'AGACCCTCAACAATGCCAAAC3'2.156bpATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAGTKGAPDH-QF5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'TKGAPDH-QR5'AACAGTCTTTTGAGTGGCAGCC3'