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聚合酶链式反应（PCR）原理与相关技术一、PCR技术二、定量PCR技术三、数字PCR技术一、PCR原理PolymeraseChainReaction(PCR)：在体外特异性地扩增某个基因。1、历史•1971年，Khorana提出体外人工复制DNA的设想。•1985年Cetus公司科学家K.B.Mullis使设想变成现实，采用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37℃），并获1993年诺贝尔化学奖。•1988年R.K.Saiki应用TaqDNA聚合酶（水生栖热菌）于PCR反应；同年，Cetus公司发明自动热循环仪。K.B.Mullis2、原理预变性－变性－退火－延伸－保存循环（30次）95℃预变性1min95℃变性1min目的：DNA双链成单链56℃退火目的：引物先与模板匹配72℃延伸1-2min目的：聚合酶在引物3’端加核苷酸，合成新链12℃保存循环特异性强、灵敏度高、快速、简便循环次数DNA数量1224382010485763010737418241、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性，不能修复错误的碱基配对，因此必须测序。需激活剂：Mg2+2、pfuDNA聚合酶：有5’→3’和3’→5外切酶活性，出错率最低，但PCR产物平端。3、TaqPlusDNA聚合酶：是Taq和pfu的混合物，TaqPCR产物3’端带－A。4、引物：互补；引物长度；3’碱基序列必须与模板配对；尽量提高GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引物二聚体。5、Tm=(G+C)×4+(A+C)×26、primer5.07、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）8、dNTP浓度2.5mMeach特殊说明：普通PCRRT-PCRTAIL-PCRReal-timePCR数字PCRPCR类型：普通PCR仪梯度PCR仪原位PCR仪定量PCR仪数字PCR仪二、实时荧光定量PCR（Real-timequantificationPCR）1、历史实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它的特异性更强、更能有效解决PCR污染问题、自动化程度更高等特点。原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如SYBRGREEN1）或特异性的荧光探针（如Taqman探针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，再通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析的方法。也就是通过荧光的变化，获得不同样品达到一定荧光信号（阈值）所需要的循环次数Ct（CycleThreshold）。Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。1、荧光探针和荧光染料：分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高，后者操作简单。SYBRGREEN1：结合双链DNA小沟后，荧光强度增强，但也会结合引物二聚体或单链引起的二级结构。变性时，双链分开，荧光消失。特别说明：TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。荧光定量PCR的优点1.荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增；2.灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量；3.既能用于定性，判断一段DNA序列的有无，也可用于定量，确定起始DNA拷贝数。一对引物引物之间一条寡核苷酸，即探针报告基因与淬灭基团完整探针，不发光；水解后，发光。FRET变性（95℃）退火（60℃）DNA聚合酶5’→3’外切酶活性；可将探针5’端的荧光基团切割下来。荧光基团游离下来后发光了！因为探针是完全与目的基因互补，当它被水解后就发光，因此发光的强度与目标基因量成正比。只与双链结合，发光；不与单链结合，不发光。随温度升高，DNA双螺旋结构降解程度的曲线即熔解曲线，可用对数图和线性图表示。在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解。染料法做，探针法不做不适合染料法卤素灯（白光）定量线性图与对数图正好相反，基线期在对数图中增高。基线荧光阈值Ct值［DNA］0基线：扩增线中的水平部分，由环境的噪音产生。实验结束软件自动分析数据，基线取默认值3-15（循环数）。如果最小的Ct值18，保持默认；如果最小的Ct值18，基线终点改成［最小的Ct值减3］，重新分析。荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上。默认阈值＝基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。［DNA］0：样本起始DNA浓度。理论上PCR是一个指数增长的过程，但实际的PCR扩增曲线并标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR因素逐渐不满足要求，PCR效率越来越低，产物增长的速度逐渐减缓。绝对处理与对照定量PCR仪特点，污染机会少定量PCR的实验因素DNA纯度：OD260/OD280=1.8,1.6-2.0之间DNA用量：0.05-100ngRNA纯度：OD260/OD280=2.0cDNA用量：1-100ng总RNA反转录的cDNA取1μl样品和标准品都需要重复，重复次数遵循统计学要求。定量PCR实验要素：目标基因：未知样品生成标准：曲线标准品梯度监控系统：阳性对照监控污染：阴性对照校准生物学误差：管家基因校准物理误差：参比荧光（ROX）降低其它误差：重复实验ABI750096孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观。ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）耗材质量（如管盖厚度、透光性）仪器稳定性（如孔间、批间温度波动）Real-timePCR方法的应用绝对定量（AbsoluteQuantification）：拷贝数；标准是已知拷贝数的质粒DNA。相对定量（RelativeQuantification）：相对变化量；内标定量。前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100%且偏差在5%以内。蛋白互作三、操作流程我们班上的刘磊同学所拍