实验三--PCR扩增技术

PCR扩增技术一．实验目的及背景多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反应过程见图。模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链；在５５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq酶催化下，在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反应，如次往复循环30次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异性和相当的扩增效率。要达此目的ＰＣＲ反应要注意以下问题：1.ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高，以增加反应特异性。2.dNTP:反应体系中达100μM～200μM。3.Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基,浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。4.引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40％－70％之间；引物内部不能有回文序列；引物３’端不能互补。5.Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。6.变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。7.复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定，它是反应特异性的决定因素。8.延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。１０×buffer:500mMKCl100mMTris-HCl(pH9.0)0.1%明胶1%TritonX-100MgCl22.5mM４×dNTP:1mM引物：actin上，actin下模板：20ng/μlTaq酶：5u/μlPCR仪，凝胶成像系统，电泳系统二．实验试剂及仪器PCR仪凝胶成像系统三.实验方法１．向无菌的200μlEppendorf管中依次加入以下溶液反应物体积2×PCRMix25μl引物上2μl引物下2μl模板ＤＮＡ2μl无菌水19μl总体积50μl2.反应体系混匀，离心3.在ＰＣＲ仪上按以下方式循环９4℃变性5分钟９4℃变性45秒30个循环55℃退火45秒72℃延伸1分钟７２℃延伸反应10分钟。4.取5μl反应液加4μlLoadingbuffer在１.５％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。5.在凝胶成像系统上观察记录实验结四.结果分析记录实验结果，并估测ＰＣＲ扩增产物分子量。问题与讨论：１．简述ＰＣＲ基本原理２．进行一次成功的ＰＣＲ反应应注意哪些问题？。