PCR技术原理

RT-PCR的基本原理RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。是一种快速、简单、敏感性极高的检测RNA的方法。RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。逆转录酶反转录酶(Reversetranscripatase)是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)的酶可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应常用的逆转录酶：鸟类成髓细胞性白细胞病毒(avianmyeloblastosisvirus,AMV)反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒(moloneymurineleukemiavrius,MMLV)反转录酶。引物引物(primer)，是指与待扩增DNA片段两翼互补的寡聚核苷酸，本质是一小段单链DNA片段，作为DNA复制的起始点。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。PCR扩增RT-PCR方法提取RNA合成cDNA•PCR特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性)--延伸三个基本反应步骤构成：•①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93~98℃一定时聚合酶链式反应间后，使模板DNA双链或经pcr扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合;•②模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至37~65℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;•③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。RT-PCR技术1一步法反转录和PCR扩增在同一管内2两步法将反转录与PCR分两步进行a.先将RNA反转录cDNAb.再以cDNA为模板用引物进行扩增一步法优点：步骤简单、快速，灵敏度高缺点：以RNA为模板，容易降解，每次扩增都需冻融RNA，对RNA保存不利优点：模板是cDNA，而不是RNA，保存方便，不容易降解，可控性强，遇到问题相对好分析缺点：麻烦，成本高两步法一步法和两步法的比较大量样品分析检测多种目的基因琼脂凝胶电泳法结果分析根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度），取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，进行分析。条带的宽度荧光的亮度PCR电泳图问题一：少量或没有RT-PCR产物RNA降解分离无污染，高质量的RNA；防止RNA降解RNA中含逆转录酶抑制剂70％（v/v）乙醇清洗RNA沉淀，除去抑制剂起始RNA量太低增加RNA的量合成cDNA第一链合成的引物退火失败确定退火温度适合所用的引物反转录成功，PCR失败PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物可能原因解决方案问题二：有非特异性带引物和模板的非特异性退火基因特异性引物设计较差提高反应的温度和特异性提高引物的特异性可能原因解决方案问题三：产生弥散（smear）条带第一链产物的含量过高PCR反应中引物过多循环数过多退火温度过低常规PCR步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量减少PCR的循环次数提高退火温度可能原因解决方案应用于基因表达检测中。用于常规检测：如的、乙肝DNA,丙肝RNA,艾滋RNA,性病，梅毒等用于疾病诊断。Thanks!