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PolymeraseChainReactionPCR多聚酶链式反应技术原理01以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成原理011234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~35轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍基本实验步骤02核酸模板引物反应缓冲系统TaqDNA聚合酶4种dNTPMg2+包括Tris-HCl（维持PH值），KCl（利于引物的退火），Taq聚合酶保护剂PCR的特异性（3’端和5’端；18-25bp；0.1-0.5µM；Tm值；4种碱基随机分布；自身避免反向重复序列；引物之间不存在互补序列；3’端选择保守的氨基酸序列；与非特异性序列的同源性）PCR的合成原料，四种dNTP浓度应相等耐高温，在热变性时不会被钝化使DNA聚合酶具有催化活性DNA/RNA，线性，小片段模板，核酸样品应除去存在对DNA聚合酶有抑制作用的有机溶剂和金属离子基本实验步骤02实验参数设置A.变性的温度与时间B.退火的温度与时间C.延伸的温度与时间D.循环数温度取决于DNA模板及PCR产物的G+C含量，时间取决于DNA的长度（95℃）温度取决于引物的G+C含量及引物的长度，退火时间不是关键因素，但也应该加以控制（60℃）温度取决于DNA聚合酶的最适温度，时间和待扩增片段长度有关（72℃）PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度（30-40次）基本实验步骤02PCR产物检测琼脂糖凝胶电泳EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm~365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光琼脂糖凝胶板的制备(1.5%)加样电泳（电压80V、时间2hr）紫外衍生PCR技术03PCR技术巢式PCR原位PCR多重PCR定量PCR逆转录PCR逆转录PCR相对于基本PCR，在开始阶段增加步骤：RNA→cDNA合成，是单链到双链的过程。引物逆转录酶RNA水解酶RealTimeqPCR荧光嵌合法(TBGreen™)荧光探针法实时荧光定量PCR技术(Real-TimeQuantitativePCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。基线（Baseline）是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。光阈值（threshold）一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期Ct(Cyclethreshold)值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数RealTimeqPCR。固定循环数后，荧光信号与模板数成正比。初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少。起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。RealTimeqPCR熔解曲线确认PCR反应的特异性。Ct值无数值（undetected）阴性Ct值≤30.0阳性Ct值30.0表达量极少RealTimeqPCR相对定量法分析结果内参/管家基因GAPDH、β-actin、18SrRNA、ACTB、β2M......（至少选择两个以上）R=2−ΔΔCt核酸表达量计算例：处理时间EGFR平均CT（目的）GAPDH平均CT（内参）NormalizedEGFR表达ΔCtCalibratedEGFR表达ΔΔCt变化倍数2−ΔΔCt0h24.512.611.9016h23.212.510.7-1.22.324h25.411.613.81.90.27（降低4倍）ThanksPCR谢谢观看