PCR技术原理

变性与复性PCR原理DNA的变性(denaturation)：在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。解链温度（融解温度，Tm）(meltingtemperature)：使50%的DNA发生变性时的环境温度。DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。DNA的复性（renaturation)：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。减色效应：变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。1.常用的变性方法：①热变性②酸碱变性③化学试剂变性2.影响复性的因素①序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快②DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢③离子强度↑→有利于复性④DNA浓度↑→复性↑Tm值的估算①20bpTm=4（G+C）+2（A+T）②20bpTm=69.3+0.41(G+C)%③Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）%-500/n-0.61×（甲酰胺%）PCR技术总论东胜创新聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。东胜创新技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶，简称TaqDNA聚合酶。多次循环后的TaqDNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。东胜创新(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。。PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextensionPCRproductPCR反应曲线标准的PCR反应体系•10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素•引物（primer）•酶（TaqDNApolymerase）•dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）•模板（template）•Mg2+（magnesium）引物•引物是PCR特异性反应的关键•PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度•理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增引物设计的原则（一）①引物长度：15-30bp，常用为20mer左右–引物的有效长度不能大于38mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性②引物扩增跨度：以500bp为宜–特定条件下可扩增长至10kb的片段③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜–G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带–ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列引物设计的原则（二）④避免引物内部出现二级结构–避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带⑤引物3’端的碱基要求严格配对–特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败⑥引物中有或能加上合适的酶切位点–被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处引物设计的原则（三）⑦引物的特异性：–引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性⑧引物量：–每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好–引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会引物设计的原则（四）•RT-PCR引物设计特别注意：–跨越两个外显子酶及其浓度•目前有两种TaqDNA聚合酶供应–天然酶：从栖热水生杆菌中提纯–基因工程酶：大肠菌合成•一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时）•浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少dNTP的质量与浓度•dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系–dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活–dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解–在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量–dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低模板（靶基因，targetgene）•模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一•传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本–SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀–蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸模板（靶基因，targetgene）•提取的核酸即可作为模板用于PCR反应•一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增•RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNAMg2+浓度•Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响•在一般的PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜•Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少PCR反应条件的选择•PCR反应条件:–温度–时间–循环次数温度与时间的设置：•设置变性-退火-延伸三个温度点•标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸•对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸①变性温度与时间：•变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因•一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性–若低于93℃则需延长时间–但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。•此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败②退火(复性)温度与时间：•退火温度是影响PCR特异性的较重要因素•变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞•退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度•对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：•Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）•复性温度=Tm值-（5～10℃）–在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性•复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合③延伸温度与时间：•TaqDNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子70℃60核苷酸/S/酶分子55℃24核苷酸/S/酶分子高于90℃时，DNA合成几乎不能进行③延伸温度与时间：•延伸温度：一般选择在70～75℃之间–常用温度为72℃–过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。•延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定–1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）–3～4kb的靶序列需3～4min–扩增10Kb需延伸至15min•延伸进间过长会导致非特异性扩增•对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些循环次数•循环次数–决定PCR扩增程度•循环次数–主要取决于模板DNA的浓度•循环次数：选在30～40次之间•循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多PCR反应特点•特异性强•灵敏度高•简便、快速•对标本的纯度要求低特异性强•关键：引物与模板的正确结合•引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的•合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高PCR反应的特异性决定因素•引物与模板DNA特异正确的结合；•碱基配对原则；•TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；•靶基因的特异性与保守性灵敏度高•PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平•从100万个细胞中检出一个靶细胞•在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)•在细菌学中最小检出率为3个细菌简便、快速•PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2~4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广对标本的纯度要求低•不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板•可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测热启动PCRTouch-downPCRRT-PCR兼并引物PCR巢氏PCR反向PCR不对称PCR原位PCR连接酶链反应RACE-PCRAFLP免疫-PCR(immuno-PCR)MSP甲基化特异PCR1）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组DNA结构功能的