PCR基因扩增及扩增产物的回收

PCR基因扩增及其产物回收佟丽2008年9月25日基因的克隆与表达专题之一主要内容•目的基因AKP的扩增－PCR•扩增产物的分离鉴定－琼脂糖电泳•扩增产物的回收－胶回收PCR产物目的产物琼脂糖凝胶分析目的基因AKP的扩增－PCR•概述•PCR技术原理•PCR特点•影响因素与条件优化•关于本次实验PCR（PolymeraseChainReaction）在体外特异性地扩增某个基因。1993年诺贝尔化学奖KaryB.Mullis概述Saiki使PCR成为实用的方法PCR的种类常规PCRTouch-downPCRRT-PCR兼并引物PCR巢氏PCR反向PCR不对称PCR原位PCRRACE-PCR免疫-PCR(immuno-PCR)MSP甲基化特异PCR等等…………常规PCRRT-PCRPCR技术原理•高温变性•低温复性（退火）•适温延伸•适度循环DNA模板高温变性:双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。95oC3’5’TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTA5’3’5’TGCATGCATATCTTGAAC3’3’5’TAGAACTTGACGTACGTA模板（template）TGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’DNA模板与引物复性(退火）:引物Primer，人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5’端相同模板模板ATCTTGAAC5’3’ACGTACGTA5’3’引物引物40-65℃DNA链的延伸：DNA聚合酶按碱基互补配对原则在模板上延伸DNA链。TGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’模板模板ATCTTGAAC5’ACGTACGTA5’TaqTaq72℃理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA变性—复性—延伸1个循环的结果新一轮循环PCR的特点特异性强：①特异的DNA引物。②高温下进行延伸敏感性高:理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！快速:整个PCR过程约2～4小时简便:对模板的纯度要求低模板种类多样化PCR反应的影响因素1、TaqDNA聚合酶2、引物3、模板4、dNTP5、Mg2+1.TaqDNA聚合酶热稳定性，耐高温最适温度：75-80℃延伸速度：2000bp/min最长延伸长度：6.7kb没有3’5’外切酶活性合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配TaquaticusTaqDNA聚合酶金属离子敏感（尤其是Mg2+），当dNTP（能结合Mg2+）为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2最佳浓度应是2.0mmol/L。50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。TaqDNA聚合酶被蛋白酶K降解无3’5’DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA有3‘5’外切酶活性，能耐受100oC高温。其它耐热的DNA聚合酶•TthDNA聚合酶：•VentDNA聚合酶：•PfuDNA聚合酶：有3‘5’外切酶活性，是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率最低的•TaqPlusDNA聚合酶：Taq和PfuDNA聚合酶的混合物Taq的PCR产物3’端往往带有一个A基因工程原理（吴乃虎）分子克隆实验指南（第三版）2.引物设计的总原则：扩增的效率和特异性5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对5’ATGACTGATCGATCGATCGAT3’3’GCTAGCTACTTAAG5’templateprimer2.1引物的碱基序列：一般长15—30bp尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力避免连续相同碱基排列或内部回文序列5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’CTGCCAGTCTAC3’GACGG5’T发卡结构2.2引物的碱基组成：2.3引物内部不能形成二级结构：尽可能随机分布，G+C含量45-55%。两个引物间不能有两个以上连续碱基互补序列2.4避免形成引物二聚体（dimer）5’GGTCTGCCAGTCTAC3’3’CAGGACTTAGTCACT5’primer1primer2引物设计现在多用专业软件如Primer5.0，DNAdatabase等Tm=（G+C)4+(A+T)2Tm=81.5+16.6(lg[K+])+0.41(%[G+C])-675/n适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。一般估计：当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55℃。2.5引物的Tm值:实际复性温度选择低于Tm值5℃2.6引物的浓度:一般使用终浓度各0.5mol/L模板的量：不能太多，100l反应体系中约100ng纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高，但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。3.模板（template)dNTPs是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称，一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L，浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率4.dNTPsTaqDNA聚合酶要求有游离的Mg2+。所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带），一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。5.Mg2+的浓度PCR反应的条件优化变性温度和时间：92-95℃，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失；退火温度与时间：引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高，通常37-55℃、1-2分钟；延伸温度和时间：72℃，接近Taq酶的最适75℃；延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间；循环次数：循环过多，非特异性产物大量增加关于本次实验大肠杆菌K12碱性磷酸酶基因序列（CDS，1.5Kb）551aagttgtcacggccgagacttatagtcgctttgtttttattttttaatgt601atttgtacatggagaaaataaagtgaaacaaagcactattgcactggcac651tcttaccgttactgtttacccctgtgacaaaagcccggacaccagaaatg701cctgttctggaaaaccgggctgctcagggcgatattactgcacccggcgg751tgctcgccgtttaacgggtgatcagactgccgctctgcgtgattctctta801gcgataaacctgcaaaaaatattattttgctgattggcgatgggatgggg851gactcggaaattactgccgcacgtaattatgccgaaggtgcgggcggctt901ttttaaaggtatagatgccttaccgcttaccgggcaatacactcactatg951cgctgaataaaaaaaccggcaaaccggactacgtcaccgactcggctgca1001tcagcaaccgcctggtcaaccggtgtcaaaacctataacggcgcgctggg1051cgtcgatattcacgaaaaagatcacccaacgattctggaaatggcaaaag1101ccgcaggtctggcgaccggtaacgtttctaccgcagagttgcaggatgcc1151acgcccgctgcgctggtggcacatgtgacctcgcgcaaatgctacggtcc1201gagcgcgaccagtgaaaaatgtccgggtaacgctctggaaaaaggcggaa1251aaggatcgattaccgaacagctgcttaacgctcgtgccgacgttacgctt1301ggcggcggcgcaaaaacctttgctgaaacggcaaccgctggtgaatggca1351gggaaaaacgctgcgtgaacaggcacaggcgcgtggttatcagttggtga1401gcgatgctgcctcactgaattcggtgacggaagcgaatcagcaaaaaccc1451ctgcttggcctgtttgctgacggcaatatgccagtgcgctggctaggacc1501gaaagcaacgtaccatggcaatatcgataagcccgcagtcacctgtacgc1551caaatccgcaacgtaatgacagtgtaccaaccctggcgcagatgaccgac1601aaagccattgaattgttgagtaaaaatgagaaaggctttttcctgcaagt1651tgaaggtgcgtcaatcgataaacaggatcatgctgcgaatccttgtgggc1701aaattggcgagacggtcgatctcgatgaagccgtacaacgggcgctggaa1751ttcgctaaaaaggagggtaacacgctggtcatagtcaccgctgatcacgc1801ccacgccagccagattgttgcgccggataccaaagctccgggcctcaccc1851aggcgctaaataccaaagatggcgcagtgatggtgatgagttacgggaac1901tccgaagaggattcacaagaacataccggcagtcagttgcgtattgcggc1951gtatggcccgcatgccgccaatgttgttggactgaccgaccagaccgatc2001tcttctacaccatgaaagccgctctggggctgaaataaaaccgcgcccgg碱性磷酸酶氨基酸序列MSRPRLIVALFLFFNVFVHGENKVKQSTIALALLPLLFTPVTKARTPEMPVLENRAAQGDITAPGGARRLTGDQTAALRDSLSDKPAKNIILLIGDGMGDSEITAARNYAEGAGGFFKGIDALPLTGQYTHYALNKKTGKPDYVTDSAASATAWSTGVKTYNGALGVDIHEKDHPTILEMAKAAGLATGNVSTAELQDATPAALVAHVTSRKCYGPSATSEKCPGNALEKGGKGSITEQLLNARADVTLGGGAKTFAETATAGEWQGKTLREQAQARGYQLVSDAASLNSVTEANQQKPLLGLFADGNMPVRWLGPKATYHGNIDKPAVTCTPNPQRNDSVPTLAQMTDKAIELLSKNEKGFFLQVEGASIDKQDHAANPCGQIGETVDLDEAVQRALEFAKKEGNTLVIVTADHAHASQIVAPDTKAPGLTQALNTKDGAVMVMSYGNSEEDSQEHTGSQLRIAAYGPHAANVVGLTDQTDLFYTMKAALGLK质粒pETblue-2（3653bp）图谱pETBlue-2克隆／表达区域PCR扩增实验流程反应体系（50μL体系）ddH2O35.7uL2.5mmol/LdNTP4uL10xbuffer*5uL引物（10umol/L）4uL模板DNA1uLEx－TaqE0.3uL（1.5U）参数设定940C,5’940C,1’550C,1’720C,2’720C,10’30次*注：PCRbuffer：10mmol/LTris-HClpH8.4(20℃)50mmol/LKCl、Mg2+0.1mg/mL乙酰BSA减少非特异性关于对照实验组：反应体系加入所有扩增所需元素每位同学作两个平行反应对照组1：反应体系中其它成分一致但不加Taq酶（用灭菌水代替），每位同学做一个反应对照组2：反应体系中其它成分一致但不加模