乳酸菌的分离、纯化与鉴定

乳酸菌的分离、纯化与鉴定第一部分：乳酸菌的分离、纯化一、实验器材:1.实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯)、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g；2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。二、实验步骤：1.培养基配制（BCG牛乳培养基）：（A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO310g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa121℃高压蒸汽灭菌20Min。以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。2.药品配制2.1结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。2.2卢哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。2.3蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。2.40.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01%KOH100ml。混合A和B液即成，按1：100稀释即可。2.4生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。3.菌悬液的配制取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水；加塞包扎于在103kPa121℃高压蒸汽灭菌20Min，得到无菌生理盐水。将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌生理盐水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液；将7只装9ml生理盐水的无菌试管，依次标记10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，再用无菌移液管吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管中，稀释混匀便得到10-2稀释液，如此重复依次制得10-3～10-7的稀释液。4.倒平板取无菌平板12个，编号标明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；将经高温消毒的培养基冷却到50℃左右，按无菌操作法倒12只平板，每皿约15ml；平置使培养基均匀分布在皿底，待凝固。5.分离方法A．平板划线接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培养48小时。B．平板涂布用三支1ml无菌移液管分别吸取10-5、10-6和10-7的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的3个无菌平板中，每个平皿放0.1ml；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上20Min；然后倒置于40℃恒温箱中培养48小时。6.脱脂乳试管的配制与灭菌直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。7.菌落观察恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约1~3mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。8.乳酸菌的分离纯化选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中，40℃培养8~24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。9.乳酸发酵及检查发酵：观察BCG培养基中乳酸菌菌落特征，选取长势比较好的菌落无菌操作下将乳酸菌接种于装有脱脂乳的试管中，40～42℃静止培养。取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体涂片；结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红复染，干燥后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌；其中保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；嗜热链球菌，呈球状，成对或短链或长链状。革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。第二部分：乳酸菌鉴定一、实验器材1.蛋白胨水培养基：蛋白胨10g,氯化钠5g,水1000ml,PH:7.2~7.4121摄氏度湿热灭菌20min2.糖发酵培养基：蛋白胨水培养基1000ml,1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2ml,PH:7.6,另配20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各10ml.3.有关试剂1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫1.6g溶于100ml乙醇中，贮存于棕色瓶中保存备用。吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛8g,95%乙醇760ml,浓盐酸160ml.10%硫酸，2%高锰酸钾含氨的硝酸盐溶液：称取硝酸银2g,蒸馏水100ml,待硝酸银溶解后，取出10ml备用，向其余的90ml硝酸银中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，继续滴加氨水至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止，再将备用的硝酸银慢慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入硝酸银，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。二、鉴定试验1.形态和培养特征观察采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下培养20～24h,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。染色方法：涂片固定；草酸铵结晶紫染1分钟；自来水冲洗；加碘液覆盖涂面染约1分钟；水洗，用吸水纸吸去水分；加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分；蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。2.生长条件试验(1)耐盐性试验(NaCl浓度:0.85、1.20和1.71)(mol/L);(2)耐酸碱试验(pH:4.3、5.7、6.8、8.4、8.6和8.7);(3)温度梯度试验(温度:10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和65℃)。分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48h,记录生长状况。3.厌氧生长测定将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入CO2培养箱37℃培养2天后,观察生长情况,生长则为阳性。含硝酸钾的营养肉汤加入2g硝酸钾入营养肉汤4.生理生化试验⑴过氧化氢酶测定将实验菌接种于PGY培养基斜面上,37℃培养20h—24h,取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应。蛋白胨、酵母膏、葡萄糖（PGY）培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖1g，蒸馏水1L。(2)甲基红（M.R）试验接种实验细菌于PYG培养基，于37℃培养2天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液，如呈红色，表示阳性。(3)吲哚试验1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2ml,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。(4).糖发酵试验1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。(5).乳酸的检测选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10ml于试管中，加入10%硫酸1ml,再加2%高锰酸钾1ml,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。（6）乙酰甲基甲醇试验（V-P试验）接种新鲜的实验菌种于培养基中,37℃培养2天后,取葡萄糖蛋白胨培养液1mL在其中加入1ml10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性.（7）明胶液化实验将实验菌接种于明胶基础培养基中,置37℃培养,以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中,等待对照管凝固后记录实验结果,反复观察对比多次。如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴性反应明胶培养基成分：NaCl5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，明胶120g，蒸馏水1000mL。制法：在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌。溶化后调pH7.2~7.4，121°C灭菌30min。(8)石蕊牛奶的反应牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色变白。观察其产酸、产碱、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、还原情况。