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二代和三代测序技术的介绍与比较二代和三代测序技术的比较I.测序技术发展II.二代测序III.三代测序IV.应用目录二代和三代测序技术的比较测序技术发展1925DNA是遗传物质1953DNA双螺旋1966遗传密码1977化学降解和Sanger测序1986第一台自动测序仪1998第一台全自动测序仪3700人基因组20002005Roche4542006IlluminaSolexaGA测序仪2007ABISolidSystem2008IlluminaHiSeq系列第一台单分子测序仪Heliscope2010第一台SMRT测序仪PacBioRSIonTorrent半导体测序仪PGM2012第一台基于Nanopore技术的MinION和GridION测序仪2015BGISEQ500二代和三代测序技术的比较测序成本二代和三代测序技术的比较二代测序技术IlluminaABISOLIDRoche454二代和三代测序技术的比较二代测序技术—IlluminaIllumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的机器采用的都是边合成边测序的方法，它的测序过程主要分为4步①DNA待测文库构建②Flowcell③桥式PCR扩增与变性④测序二代和三代测序技术的比较Illumina测序仪比较NextSeq系列HiSeq系列HiSeqX系列NovaSeq系列最大输出120Gb1500Gb1800Gb6000Gb运行时间12-30hr1–3.5days（Hiseq3000/4000）7hr-6days(Hiseq2500)3days19–40hr每次运行产生的最大read数400million5billion6billion20billion最大读长2×150bp2×150bp2×150bp2×150bp每个样本的相对价格HigherCostMidCostLowerCostLowerCost仪器的相对价格LowerCostMidCostHigherCostHigherCost二代和三代测序技术的比较Illumina测序仪的选择二代和三代测序技术的比较二代测序—Roche454Roche454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。二代和三代测序技术的比较二代测序—Solid文库制备油包水PCRBeads固定连接测序引物resetECCSOLiD使用连接法测序，基于“双碱基编码原理”获得SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。二代和三代测序技术的比较二代测序—Solid二代和三代测序技术的比较二代测序—分析流程Germline二代和三代测序技术的比较二代测序—分析流程Somatic二代和三代测序技术的比较二代测序—临床应用生育健康癌症遗传病用药指导传染病移植分型个体健康对比项传统方法高通量测序大片段检测FISH不受邻近片段的影响突变检测Sanger检测单个基因同时检测多基因检测灵敏度Sanger15-20%可以达到0.5%表达量检测IHC，芯片，qPCR完全定量在肿瘤临床中的应用优势临床应用二代和三代测序技术的比较二代测序—肿瘤研究肿瘤发生发展机理肿瘤分子标记物肿瘤分子分型肿瘤病理关联研究方向遗传性肿瘤家系队列研究研究方法TCGACosmicONCOMINEUCSCXenacBioPortal......数据库及数据挖掘二代和三代测序技术的比较队列分析—案例AlignmentandqualityassessmentVariantcalling（SNVfiltering，Indelfiltering）Pathogenicgermlinevariants（MutSigCV）CopynumberanalysesensurehotspotsvariantswithlowVAF(2-10%)AssessthesensitivityandspecificityofvariantcallsSurvivalanalysesDrivergeneidentificationClonalstatesofMut-drivermutationsIntra-tumourheterogeneityNaturecommunications,2016,Breastcancer二代和三代测序技术的比较三代测序1.单分子测序2.PacBio/SMRT3.Oxford/Nanopore4.Thermo/IonTorrent二代和三代测序技术的比较三代测序—SMRT•PacBioSMRT技术应用了边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体。•4色荧光标记4种碱基，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。•通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。•SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。•DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一。•测序错误率比较高，通过多次测序纠错。二代和三代测序技术的比较三代测序—Nanopore基本原理当DNA碱基通过纳米孔时，使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。OxfordNanoporeTechnologies公司所开发的纳米单分子测序技术，是基于电信号的测序技术。二代和三代测序技术的比较Nanopore主要特点•读长长，大约在几十kb，甚至100kb•错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在reads的两端;•数据可实时读取；•通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成)；•样品制备简单又便宜，不破坏DNA;•直接读取甲基化修饰位点，准确率可达99.8%二代和三代测序技术的比较三代测序—IonTorrent基本原理当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时，会释放出一个氢离子，反应池中的PH发生改变，位于池下的离子感受器感受到H+离子信号，H+离子信号再直接转化为数字信号，从而读出DNA序列。IonTorrent是一种基于半导体芯片的新一代革命性测序技术。特点不需要昂贵的物理成像等设备，成本相对较低，体积小，操作简单；快速，除了2天文库制作时间，整个上机测序可在2-3.5小时内完成；不过整个芯片的通量并不高，目前是10G左右，适合小基因组和外显子验证的测序。二代和三代测序技术的比较IonTorrent—shortreads二代和三代测序技术的比较IonTorrent—longreads二代和三代测序技术的比较IonTorrent主要应用靶向测序转录组测序异倍性和CNV分析小分子RNA和miRNA测序病毒分型外显子组测序微生物测序通过测序进行基因分型DeNovo从头测序细菌分型二代和三代测序技术的比较三代测序技术应用全基因组测序从整体上以单碱基对分辨率检测结构变异。更高质的人类基因组全新组装；生成高品质的植物、动物基因组；同时检测表观遗传信息；在单次实验中进行完整的微生物基因组测序；靶向捕获测序表征人类遗传疾病的复杂区域；解决微生物和传染病研究中的复杂区域；获得全长HLA等位基因变异而无插补；表征复杂免疫区域的扩增单体型；直接检测转录本的全长，消除了使用算法对转录本进行重建的步骤二代和三代测序技术的比较三代测序在肿瘤研究中的应用SMRT测序能够提供有关癌症基因组复杂性最全面的观点•通过对Iso-form多样性的完整检测（包括基因融合、剪接位点和内含子等）发现癌症样本中隐藏的生物学机制；•以极高的分辨率检测SV，包括CNV的基因组背景、插入/缺失/倒位/易位的准确断点以及不稳定的微卫星标志物的完整序列；•靶向检测基因或大型基因组的特定区域，直接检测其变异，揭示耐药机制；•更完整的测序帮助还原更全面的免疫反应原貌。二代和三代测序技术的比较三代测序—研究热点基因组组装（2+3）微生物16S分析算法开发二代和三代测序技术的比较二代测序技术的比较公司平台名称测序方法检测方法大约读长(碱基数)优点相对局限性第二代Roche/454基因组测序仪FLX系统焦磷酸测序法光学230-400在第二代中最高读长；比第一代的测序通量大样品制备较难；难于处理重复和同种碱基多聚区域；试剂冲洗带来错误累积；仪器昂贵IlluminaHiSeq2000,HiSeq2500/MiSeq可逆链终止物和合成测序法荧光/光学2x150很高测序通量仪器昂贵；用于数据删节和分析的费用很高ABI/Solid5500xlSolid系统连接测序法荧光/光学25-35很高测序通量；在广为接受的几种第二代平台中，所要拼接出人类基因组的试剂成本最低测序运行时间长；读长短，造成成本高，数据分析困难和基因组拼接困难；仪器昂贵第三代太平洋生物科学公司PacBioSMRT实时单分子DNA测序荧光/光学~1000高平均读长，比第一代的测序时间降低；不需要扩增；最长单个读长接近3000碱基并不能高效地将DNA聚合酶加到测序阵列中；准确性一次性达标的机会低（81-83%）；DNA聚合酶在阵列中降解；总体上每个碱基测序成本高（仪器昂贵）；IonTorrent/生命技术公司PGM合成测序法以离子敏感场效应晶体管检测pH值变化100-200对核酸碱基的掺入可直接测定；在自然条件下进行DNA合成（不需要使用修饰过的碱基）一步步的洗脱过程可导致错误累积；阅读高重复和同种多聚序列时有潜在困难；牛津纳米孔公司gridION纳米孔外切酶测序电流尚未定量有潜力达到高读长；可以成本生产纳米孔；无需荧光标记或光学手段切断的核苷酸可能被读错方向；难于生产出带多重平行孔的装置THANKYOU