同源重组

整理文档很辛苦,赏杯茶钱您下走!

免费阅读已结束,点击下载阅读编辑剩下 ...

阅读已结束,您可以下载文档离线阅读编辑

资源描述

第四章DNA重组DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合,称为遗传重组(geneticrecombination),或者基因重排(generearrangement)。重组产物为重组体DNA(recombinantDNA)。DNA的重组广泛存在于各类生物。真核生物基因间重组多发生在减数分裂(meiosis)时同源染色体之间的交换(crossover)。细菌及噬菌体的基因组为单倍体,来自不同亲代两组DNA之间可通过多种方式进行遗传重组。DNA重组对生物进化起着关键的作用。生物进化是生物随时间发生变化和多样化的过程。生物进化以不断产生可遗传的变异为基础。首先有突变和重组,由此产生遗传的变异,然后才有遗传漂变(geneticdrift)和自然选择(naturalselection),才有进化。可遗传变异的根本原因是突变。然而,突变的机率很低,而且多数突变是有害的。如果生物只有突变没有重组,在积累具有选择优势的突变同时不可避免积累许多难以摆脱的不利突变,有利突变将随不利突变一起被淘汰,新的优良基因就不可能出现。重组的意义在于,它能迅速增加群体的遗传多样性(diversity);使有利突变与不利突变分开(separation);通过优化组合(optimization)积累有意义的遗传信息。此外,DNA重组还参与许多重要的生物学过程。它为DNA损伤或复制障碍提供修复机制。某些生物的基因表达受DNA重组的调节。DNA重组包括同源重组(homologousrecombination)、位点专一性重组(site-specificrecombination)和转座重组(transpositionrecombination)等类型,以下分别介绍。一、同源重组同源重组又称一般性重组。同源重组发生在DNA的同源序列之间,真核生物非姊妹染色单体的交换,姊妹染色单体的交换,细菌及某些低等真核生物的转化,细菌的转导、接合等都属于这—类型。Holliday对遗传重组的可能机制成功提出了一个模型予以说明。在分子水平上了解重组过程是在细菌的研究中加以解决的。(一)Holliday模型RobinHolliday于1964年提出一个模型,对于认识同源重组起了十分重要作用(图4-1)。在这一模型中,关键步骤有四个:①两个同源染色体DNA排列整齐;②一个DNA的一条链裂断并与另一个DNA对应的链连接,形成的连接分子(jointmolecule),称为Holliday中间体(intermediate);③通过分支移动(branchmigration)产生异源双链(heteroduplex)DNA;④Holliday中间体切开并修复,形成两个双链重组体DNA。切开的方式不同,所得到的重组产物也不同。如果切开的链与原来断裂的是同一条链(见Holliday模型左边的产物),重组体含有一段异源双链区,其两侧来自同一亲本DNA,称为片段重组体(patchrecombinant)。但如切开的链并非原来断裂的链(模型右边产物),重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA,称为拼接重组体(splicerecombinant)。Holliday模型能够较好解释同源重组现象,但也存在问题。该模型认为进行重组的两个DNA分子在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂。DNA分子单链断裂是经常发生的事,但很难设想两个分子何以能在同一位置发生断裂。MeselsonM和RaddingC对此提出了修正意见,他们认为同源DNA分子中只有一个分子发生单链断裂,随后单链入侵另一DNA分子的同源区,造成链的置换,被置换的链再切断并与最初断链连接,即形成Holliday中间体。但是更多的事实表明,重组是由双链断裂所启动。现在认为,同源重组是减数分裂的原因,而不是减数分裂的结果。DNA分子双链断裂才能与同源分子发生链的交换,藉以将同源染色体分配到子代细胞中去。因此,双链断裂启动重组,也启动了减数分裂。DNA的重组1.同源重组•Holliday模型图4-1同源重组的Holliday模型两同源DNA分别以粗线和细线表示图4-2双链断裂启动重组DNA同源重组是一个十分精确的过程,哪怕只有一个核苷酸的差错都会造成基因失活。同源重组的分子基础是链间的配对,通过碱基配对才能找到正确位置,进行链的交换。当两同源DNA分子之一发生双链断裂,经核酸酶和解螺旋酶作用,产生具有3′末端的单链,它在另一DNA分子的同源区寻找互补链并与之配对。相对应的链则被置换出来,与原来断裂的链配对经修复合成和链的再连接,形成两个交叉,而不是单链交换时形成的一个交叉。值得注意的是,在两交叉之间,由交换和分支移动产生的是异源双链,而由修复合成产生的是同源双链(图4-2)。实验表明,两DNA分子必需具有75bp以上的同源区才能发生同源重组,同源区小于此数值将显著降低重组率。不同生物体内同源重组的具体过程可以有许多变化,但基本步骤大致相同。同源性并不意味序列完全相同。两DNA分子只要含有一段碱基序列大体类似的同源区,即使相互间略有差异,仍然可以发生重组。同源重组是最基本的重组方式,它参与各种重要的生物学过程。复制、重组和重组修复三个过程是密切相关的,许多有关的酶和辅助因子也都是共用的。同源重组也在基因的加工、整合和转化中起着重要的作用。(二)细菌的基因转移与重组细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移,并通过基因重组以适应随时改变的环境。这种遗传信息的流动不仅发生在种内,也发生在种间,甚至与高等动植物细胞之间也存在横向遗传传递(horizontalgenetictransmission)。例如,从人体内寄生的细菌基因组中可以找到确定属于人类的基因。被转移的基因称为外基因子(exogenote),如果与内源基因组或称内基因子(endogenote)的一部分同源,就成为部分二倍体(partialdiploid),这种情况下可以发生同源重组。细菌的基因转移主要有四种机制:接合(conjugation)、转化(transformation)、转导(transduction)和细胞融合(cellfusion)。进入受体细胞(recipientcell)的外源基因通常有四种结果:降解、暂时保留、与内源基因置换和发生整合。1细菌的接合作用细菌的细胞相互接触时遗传信息可以由一个细胞转移到另一个细胞,称为接合作用。供体细胞被定义为雄性,受体细胞为雌性。通过接合而转移DNA的能力是由接合质粒(conjugativeplasmid)提供的,与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子(fertilityfacter),简称为性因子或F因子。大肠杆菌F质粒(F因子)是研究得最多,也是研究得最清楚的一种接合质粒。F质粒是双链闭环的大质粒,总长约100kb,复制起点为oriV。F质粒可以在细胞内游离存在,也可以整合到宿主染色体内,因此属于附加体(episome)。其与转移有关的基因(tra)占据质粒的三分之一(~33kb),称为转移区,包括编码F性菌毛(Fpilus)、稳定接合配对、转移的起始和调节等,总共约40个基因。2遗传转化(genetictransformation)是指细菌品系由于吸收了外源DNA(转化因子)而发生遗传性状的改变现象。具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞(competentcell)。很多细菌在自然条件下就有吸收外源DNA的能力(如固氮菌、链球菌、芽孢杆菌、奈氏球菌及嗜血杆菌等),虽然感受态经常是瞬时的,与特定的生理状态有关。转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能。有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很低,但在实验室中可以人工促使转化。例如大肠杆菌,用高浓度Ca2+处理,可诱导细胞成为感受态,重组质粒得以高效转化。人工转化的机制目前还不十分清楚,可能与增加细胞通透性有关。3转导(transduction)是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。转导有两种类型:普遍性转导(generalizedtransduction),是指宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌;局限性转导(specializedtransduction),某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合部位的DNA切割下来取代病毒DNA。在上述两种类型中,转导噬菌体均为缺陷型,因为都有噬菌体基因被宿主基因所取代。缺陷型噬菌体仍然将颗粒内DNA导入受体菌,前宿主的基因进入受体菌后即可与染色体DNA发生重组。4在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。在实验室中,用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖,使之成为原生质体,可人工促进原生质体的融合,由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。(三)重组有关的酶已经分离并鉴定了原核生物和真核生物促进同源重组各步骤有关的酶,研究最多的还是大肠杆菌的酶。在大肠杆菌中,RecA蛋白参与重组是最关键的步骤。RecA有两个主要的功能:诱发SOS反应和促进DNA单链的同化(assimilation)。所谓单链同化即是指单链与同源双链分子发生链的交换,从而使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的形成,分支移动等步骤得以产生。当RecA与DNA单链结合时,数千RecA单体协同聚集在单链上,形成螺旋状纤丝(helicalfilament)。RecF、RecO和RecR蛋白调节RecA纤丝的RecA蛋白相对分子质量为38000,它与单链DNA结合形成的螺旋纤丝每圈含六个单体,螺旋直径10nm,碱基间距0.5nm。此复合物可以与双链DNA作用,部分解旋以便阅读碱基序列,迅速扫掠寻找与单链互补的序列。互补序列一旦被找到,双链进一步被解旋以允许转换碱基配对,使单链与双链中的互补链配对,同源链被置换出来(图4-3)。链的交换速度大约为6bp/s,交换沿单链5′→3′方向进行,直至交换终止,在此过程中由RecA水解ATP图4-3RecA蛋白介导的DNA链交换模型A:DNA链交换的侧面观:1.RecA蛋白与单链DNA结合;2.复合物与同源双链DNA结合;3.入侵单链与双链中的互补链配对,同源链被置换出来;B:DNA链交换过程RecA任何部位的单链DNA都能借助RecA蛋白与同源双链DNA进行链的交换。单链DNA可以由许多途径产生,RecBCD酶是产生参与重组的DNA单链主要途径。该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码。RecBCD酶具有三种酶活性:①依赖于ATP的核酸外切酶活性,②可被ATP增强的核酸内切酶活性,③ATP依赖的解螺旋酶活性。当DNA分子断裂时,它即结合在其游离端,使DNA双链解旋并降解,解旋所需能量由ATP水解供给。及至酶移动到chi位点(5′GCTGGTGG3′),在其3′侧4~6个核苷酸处将链切开,产生具有3′末端的游离单链。随后单链可参与重组各步骤。大肠杆菌基因组共有1009个chi位点,分布在DNA各部位,平均5kb有一个,由于DNA分子具有螺旋结构,在持续进行链的交换时需要两DNA分子发生旋转。RecA能够介导单链绕入另一DNA分子,并水解ATP。一旦Holliday中间体形成,即由RuvA和RuvB蛋白促进异源双链的形成。RuvA蛋白能够识别Holliday联结体(junction)的交叉点,RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象,使得分支点易于移动,RuvA还帮助RuvB六聚体环结合在双链DNA上,位于交叉点上游。RuvB是一种解螺旋酶,通过水解ATP而推动分支移动(图4-4)。RuvAB复合物的移动速度约为10~20bp/s。同源重组最后由RuvC将Holliday联结体切开,并由DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复合成。RuvC是一种核酸内切酶,特异识别Holliday联结体并将其切开。它识别不对称的四核苷酸ATTG,此序列因而成为切开Holliday联结体的热点,并决定图4-4RuvAB复合物结合于Holliday联结体的模型结果是片段重组还是拼接重组,即异源双链区两侧来自同一分子还是不同分子。

1 / 69
下载文档,编辑使用

©2015-2020 m.777doc.com 三七文档.

备案号:鲁ICP备2024069028号-1 客服联系 QQ:2149211541

×
保存成功