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基因工程实验——实验五：DNA体外重组实验目的与要求•掌握体外DNA的重组过程；•学习外源DNA分子经限制性内切酶切割后与载体的连接及转化过程；•学习对DNA重组子的筛选方法。•实验原理•实验材料•实验步骤•预期结果•注意事项一、实验原理1、DNA重组简介2、DNA连接酶3、TA克隆4、蓝白筛选•DNA重组是外源DNA与载体分子的连接，重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2＋、ATP存在的连接缓冲系统中，将经过酶切的或脱磷酸处理的载体分子与外源DNA分子进行连接。这样经过重新组合的DNA叫做重组体或重组子。1、DNA重组简介DNA重组包括如下步骤：•外源DNA片段的制备；•载体的选择；•DNA片段与载体连接；•导入宿主细胞。2种连接酶——T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。（1）大肠杆菌DNA连接酶仅能连接具有相同粘性末端的两个DNA分子。2、DNA连接酶（2）T4噬菌体DNA连接酶•不仅能连接具有相同粘性末端的两个DNA分子，还可以连接平末端双链DNA分子。•但后者连接效率比较低，一般可提高T酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。2、DNA连接酶T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：•首先，T4连接酶与辅助因子AMP形成酶-AMP复合物；•然后，酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；•最后，产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。酶最适温度为37℃，但该温度下粘性末端氢键不稳定，所以连接反应一般采取12~16℃连接过夜。磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶目的基因与载体的连接3、TA克隆•将3´端具有单个“A”突出末端的PCR产物克隆到3´端具有单个“T”突出末端的线性化载体的克隆法。4、蓝白筛选•pUC质粒载体含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacz）的启动子（受IPTG诱导）及其编码α肽链（β-半乳糖苷酶的氨基末端短片段）的DNA序列（特称为lacz’基因）。位于lacz’基因中靠近5’端有一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。•受体大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶发生了突变，失去的氨基末端。•当lacz’基因编码的α肽链同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突变体互补时，便会产生出有活性的β-半乳糖苷酶分子，在IPTG诱导下，会启动表达，分解X-gal产生蓝色背景。•当MCS中插入外源基因后，会阻断α肽链合成，不能形成互补，不能产生功能活性的β-半乳糖苷酶，也就不会产生蓝色背景。•所以含有重组质粒载体的克隆是白色的。二、实验材料•l、仪器和材料•感受态细胞(如E.coliJMl09、DH5a)•恒温培养箱，恒温摇床，恒温水浴槽，1.5mL微量离心管（Ep管），微量取液器200μL及20μL吸头，电泳仪，电泳槽。•2、试剂•(1)载体：质粒pUCl8/19•(2)目的基因：如小牛胸腺DNA•(3)限制性内切酶：EcoRI，HindⅢ•(4)T4DNA连接酶•(5)0.1mol/LCaCl2溶液•(6)LB琼脂固体平板（含氨苄青霉素）•(7)5mLLB液体培养基（含氨苄青霉素）•(8)20mg/mLX-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）•(9)200mg/mLIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）•(10)琼脂糖•(11)无菌双蒸水三、实验步骤•1、双酶切目的基因及载体（TA克隆法可省此步）•2、连接与转化•3、培养观察1、连接（5μL体系）：pEASYT31μLPCR纯化产物1-4μL（Taq酶扩增）25℃连接15min。一般，载体:外源基因（摩尔比）=1:2~1:102、转化：10μL连接产物全用来转化200μL大肠杆菌感受态细胞。在含Amp的LB平板上，添加40μL20mg/mLX-gal及4μL200mg/mLIPTG，然后涂布转化后的细胞。3、培养：37℃，倒置培养16h后，观察结果。计数白色和蓝色菌落。四、预期实验结果37℃倒置培养12~16h后，平板上可见生长有蓝色和白色的菌落，其中白色菌落含有重组DNA，蓝色菌落含有未重组成功的质粒DNA五、注意事项•双酶切时，注意选择合适高效的2种酶，注意双酶的缓冲液、温度的协调。•酶的加入量须小于反应体积的1/10，否则酶液中所含有甘油会抑制酶解反应。•注意连接体系中，载体与插入片段之间的摩尔比。插入片段所需量（ng）=载体含量（ng）*插入片段长度（kb）载体长度（kb）*片段与载体摩尔比时间安排•8:30——9:30讲课•9:30——11:30连接，连接过程中倒固体LB平板，清点器皿，清洗后归还，吃午饭•12:00以后连接•第二天观察结果THEEND