第三章菌种选育

第三章菌种选育的理论与技术微生物发酵制药工艺过程：菌种斜面培养种子制备发酵发酵液预处理提取精制成品检验成品包装菌种选育发酵工艺提取工艺微生物发酵工业化生产生物药物的三大环节：发酵工艺提取工艺菌种选育第一节概述一、菌种选育的目的（掌握）①提高发酵产量②改进菌种性能③产生新的发酵产物④去除多余的组分青霉素：20IU/ml----85000IU/ml青霉素产黄色素、土霉素产泡沫的消除提高有用组分含量，方便纯化二、菌种选育的基本理论（一）遗传与变异（理解）菌种选育的最基本理论遗传：子代和亲代间的连续性，相似性的现象。变异：子代与亲代间的不连续性，差异性。基因型：一个个体所具有的内在遗传基础表型：基因突变形成新的基因型在一定条件下表现出来的个体性状。意义：遗传性使高产菌株能够保留下来，供后人使用；变异性使诱变育种提高发酵水平得以施行。微生物菌种的遗传特性使菌种能够不断延续其后代，保持菌种稳定性。本质：亲代的遗传基因传递给子代，使子代具有与亲代相同的基因，从而发育成相似的个体。（二）遗传与变异的物质基础（了解）物质基础：DNADNA中核苷酸的特定排列顺序，对遗传起决定作用。基因的产物为蛋白质或酶，基因的改变，导致相应蛋白质或酶的改变，从而引起生物体表型的变化。脱氧核糖核酸（DNA），是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。有时被称为“遗传微粒”，因为在繁殖过程中，父代把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。三联密码（三）基因突变的本质与类型（了解）基因突变的本质：DNA中核苷酸碱基的化学结构和排列顺序或数目发生变化，导致生物体表型改变。这种表型改变可稳定地一代代传递下去，也可称为遗传变异。遗传变异的类型（熟悉）一、自发突变二、诱发突变微生物未经人为诱变处理或杂交等生物技术手段而自然发生地突变。原因：1.环境中存在低剂量的物理、化学诱变因素（宇宙紫外线、短波辐射、高温、病毒等）2.生长过程中，DNA复制过程中发生错误。3.微生物自身代谢过程中产生一些具有诱变作用的物质，如过氧化氢、硫氰化合物等。特点：速度慢，时间长、突变频率低，一般为10－7～10－9一、自发突变：二、诱发突变：人为用化学、物理诱变剂（紫外线、亚硝酸等）去处理微生物而引起的突变。特点：速度快、时间短、突变频率高，一般大于10－4。突变类型按遗传变异后DNA结构发生改变的程度、突变又可分为基因突变、染色体畸变和染色体组突变。1）基因突变：DNA结构发生较小的损伤，碱基发生变化，包括a.碱基置换（P37）：DNA链上的碱基序列中一个碱基被另一个碱基代替的现象。其中嘌呤（A和G）之间或嘧啶（T和C）之间发生的互换称转换。嘌呤和嘧啶之间的替换称颠换。b.移码突变（P38）：碱基序列中有一个或几个碱基增加或减少而产生的变异。c.易位突变（P38）：DNA链上一个密码子中的某个碱基和临近密码子中的一个碱基对换，造成两个密码子编写的氨基酸都发生改变，从而引起突变。2）染色体畸变：染色体结构的变化导致遗传信息的改变，具遗传效应。多数由于染色体受巨大损伤，使其断裂。根据断裂数目、位置、断裂端连接方式等的不同，可分为a.缺失（P38）：同一染色体上具有一个或多个基因的DNA片段丢失引起的突变。b.重复（P38）：在同一条染色体的某处增加一段DNA片段，使该染色体的某些基因重复出现产生突变。c.倒位（P38）：染色体受外来因素的破坏，造成染色体部分节段的位置顺序颠倒，极性相反。d.易位（P38）：同源染色体之间部分连接或交换。断裂后的一段染色体，加入到另一条非同源染色体的某个位置中。3）染色体组突变：染色体数目的变化，可分为整倍体和非整倍体。突变的过程1.诱变剂与微生物细胞的作用：2.诱变剂与DNA的作用：DNA是否处在复制状态与其接触诱变剂后能否发生基因突变有密切关系。3、突变体的形成：突变不一定形成稳定突变体，当突变发生后，只有经过复制，才能成为突变体。突变的修复DNA结构被改变后有两种可能：一种是突变的DNA分子在复制过程中克服了修复系统的作用而成为突变体；另一种是被修复系统修补后恢复原有DNA分子结构不能形成突变体。用紫外线诱发微生物突变，主要效应是使DNA单链上的临近两个嘧啶碱基结合形成嘧啶二聚体。由于在二聚体的位置上碱基不能正常配对，使DNA复制和RNA转录不能正常进行。由紫外线诱发损伤的修复，可分为光修复和暗修复修复方式1、光修复：细菌经紫外线照射后，再用可见光照射，突变率降低的现象称为光复活。酶促反应，光复活酶可以将单链的嘧啶二聚体分解成单体。2、切补修复（暗修复）：切除嘧啶二聚体使DNA分子修复。可先切后补或先补后切，修复过程在限制性内切核酸酶、外切核酸酶等的作用下进行。3、重复修复：指损伤的DNA经过复制后完成修复过程。4、SOS修复5、DNA聚合酶的校正作用表型延迟（理解）表型延迟（P41）：指微生物表型的改变总是落后于基因型改变的现象。产生原因1.诱变剂作用的延迟2.多核细胞中的单个核突变3.原有基因产物的影响。多核细胞中，通过几代繁殖分裂，直到一个细胞中所有细胞核都含突变基因时，表型才会发生改变。原来产生的酶起着支配野生型细胞表型的作用，几代繁殖后，酶浓度降低，才表现出突变基因的表型。第二节自然选育自然选育：利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产水平菌株的过程。以达到稳定和提高生产能力的目的。优点：简单易行缺点：效率低、进展慢以微生物的自然变异作为基础的生产选种机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。自然选育的一般过程（重点）生产菌种斜面制备单孢子（或细胞）悬浮液涂布平板、培养后挑取单菌落斜面种子培养摇瓶发酵高产菌株初选菌种保藏斜面种子培养摇瓶种子培养摇瓶发酵高产菌株复选高产菌株验证作用：对菌种进行分离纯化，获得遗传背景较为纯一的细胞群体。初筛复筛自然选育的操作方法1、单孢子悬液的制备：无菌生理盐水或缓冲液、摇瓶。2、稀释及单菌落培养：梯度稀释（50～200/ml），平板培养（10－50/皿）3、单菌落传斜面：接种环挑取，每个单菌落传一只斜面4、摇瓶初筛：将斜面培养成熟后直接入发酵摇瓶中，发酵后测定发酵单位，初筛高产菌株。5、菌种保藏：挑选高产菌株保藏6、摇瓶复筛：对初筛高产菌株的验证，挑选稳定高产菌株。采用二级发酵（种子摇瓶－发酵摇瓶），重复3－5次。须以出发菌株作对照。7、放大试验：改进发酵条件，达到工业化生产要求。第三节诱变育种诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群体，促进其突变率大幅提高，然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出少数具有优良性状的突变菌株。优点：速度快、收效大、方法简单诱变剂类型：物理诱变剂、化学诱变剂、生物诱变剂一．物理诱变剂：物理辐射，如紫外线、X射线，激光、电磁波等二．化学诱变剂：一类能与DNA发生作用、改变其结构、并引起遗传变异的化学物质，常用包括碱基类似物、烷化剂、移码突变剂等。三．生物诱变剂：一些能引起DNA结构改变，从而造成突变效应的生物体或生物分子。噬菌体、人工构建的质粒、转座子。常用诱变剂（熟悉）1、紫外线：有效波长：200～300nm，15W紫外灯管诱变效果好。辐射剂量：灯管功率和距离固定时，剂量与照射时间成正比；照射剂量与杀菌率在一定范围成正比，高致死剂量（90-99%）、中等剂量（70-80%）80%波长集中在253.7nm出发菌株的培养孢子悬液或菌悬浮液的制备紫外线照射后培养稀释涂平板诱变过程2、亚硝基胍（NTG）黄色结晶，性质不稳定，遇光易分解；棕色瓶避光干燥保存。诱变作用极强，PH影响诱变效果，常用缓冲溶液配制。诱变处理方法：制备菌悬液－配制NTG母液－NTG与菌体的作用－NTG作用的终止－稀释涂平皿3、硫酸二乙酯（DES）处理方法：同上终止处理：2%Na2S2O3溶液0.5ml4、亚硝酸：终止处理：pH8.6磷酸氢二钠缓冲液生理盐水洗涤菌体，离心后重新制备菌悬液1~3mg/ml、30~120min、26~32℃新型诱变剂激光、微波、离子注入、高能电子流诱变的主要环节（重点）（一）出发菌株的选择（二）诱变处理（三）突变株的筛选（一）出发菌株的选择1、选择纯种菌株2、选择具有优良性状的菌株：产量高，产孢子早而多，色素少、生长速度快等。3、选择对诱变剂敏感的菌株4、选用多个出发菌株进行诱变收效较快提高突变频率（二）诱变处理（重点）1、诱变剂的选择：“量体裁衣”，不经常采用一种诱变剂反复处理，防止诱变效应饱和。2、诱变剂用量的选择：致死率高的剂量负变株多，但变异幅度大、效率高；中等剂量高产菌株出现率高，效率不高，速度慢。3、影响诱变效果的因素：菌种生理状态、被处理菌株的预培养和后培养条件、诱变处理时外界条件等。4、诱变的一般过程：单孢子悬浮液的制备－诱变剂处理－梯度稀释－涂布分离平板（三）突变株的筛选筛选：将分离培养后的各型单菌落中性状优良、具有高发酵能力的突变菌株挑选出来过程。初筛：从大量菌株中发现有苗头的优良菌株，筛选量大，准确度要求不是很高。复筛：注重准确性和可重复性。一支菌种要接种3～5个发酵摇瓶，采用二级发酵，力求试验结果准确可靠筛选方法1、随机筛选2、理性化筛选1、随机筛选：随机挑选平板分离后的单菌落，从中筛选具有优良性状的菌株。（1）摇瓶筛选法（2）琼脂块筛选法摇瓶筛选法操作步骤平板分离单菌落接种斜面培养摇瓶发酵测定生物活性物质含量高产菌株的筛选初筛→复筛琼脂块筛选法抗生素产生菌孢子悬液诱变处理涂布平板打孔取单菌琼脂块，放入另一无菌空培养皿中将琼脂块转移到生物鉴定平板上1～2d28℃、3－5d通过抑菌圈的大小判定生物效价的高低，高效价的琼脂块，接种斜面培养基、摇瓶发酵筛选抗生素高产菌株的筛选2、理性化筛选：根据产物已知或可能的生物合成途径、代谢调控机制和分子结构设计的一些筛选方法。打破微生物原有代谢调控机制，获得能大量形成发酵产物的高产突变株。（1）初级代谢产物高产菌株的筛选营养缺陷型突变株的筛选氨基酸结构类似物抗性突变菌株的筛选细胞膜透性突变株的筛选初级代谢产物：与菌体的生长繁殖有密切关系的代谢产物，如氨基酸、核苷酸、维生素等小分子，以及蛋白质、多肽、核酸等大分子产物。1、营养缺陷型突变菌株的筛选营养缺陷型:诱变产生的缺乏合成某些营养物质的能力，须在基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。野生型:与营养缺陷型对应的是野生型。基本培养基(MM)：能满足野生型菌株正常生长的培养基补充培养基(SM)：在基本培养基中加入相应的营养成分的培养基完全培养基(CM)：能满足各种营养缺陷型生长的培养基选育高产赖氨酸产生菌，可以筛选高丝氨酸的营养缺陷型突变菌株，由于突变株中高丝氨酸脱氢酶失活，不能合成高丝氨酸，使其全部用于赖氨酸的生物合成，有利于赖氨酸的合成。天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰－β－半醛高丝氨酸蛋氨酸苏氨酸α－丙酮酸异亮氨酸天冬氨酸激酶反馈抑制赖氨酸高丝氨酸脱氢酶（HD）争夺底物，解除反馈抑制2、氨基酸结构类似物抗性突变菌株的筛选氨基酸结构类似物：与某种氨基酸在化学结构上仅有微小差异的化合物。与氨基酸具有相似生物学功能，不能被菌体用来合成蛋白质。•结构类似物：结构与代谢产物类似的化合物特点：有反馈调节作用无正常生理功能结构类似物抗性突变株的筛选氨基酸类似物反馈阻遏或反馈抑制对应氨基酸的生物合成，使该种氨基酸产生菌不能在该平板生长。经诱变后，能在该培养基上生长的突变菌株解除了终产物的反馈调节，因而可以积累过量相应氨基酸。基本培养基加入氨基酸结构类似物涂布氨基酸产生菌解除了终产物反馈调节的突变菌株3、细胞膜通透性突变株的筛选微生物产生的代谢产物如果累积在细胞内的浓度高，容易产生反馈调节作用阻止这种代谢产物的继续合成。改变细胞通透性，使发酵产物大量分泌到胞外，可避免终产物的反馈调节。改变细胞的通透性可采用：油酸缺陷型突变株生物素缺陷型突变株丧失合成油酸能力，形成渗漏型细胞磷脂合成受影响，改变细胞膜结构，提高细胞通