蛋白质组学与分析技术第三讲

1蛋白质组学与分析技术邱德文中国农科院植物保护研究所2010。3。242蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法1、透析和超过滤利用蛋白质分子不能透过半透膜将其与小分子物质分开半透膜为玻璃纸或纤维素材料3利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀调整溶液pH不同蛋白在各自pI处依次沉淀2.盐溶和盐析3.有机溶剂分级分离法降低介电常数争夺水化膜4蛋白沉淀步骤硫酸铵沉淀（盐析）：高盐溶液中蛋白质聚合而沉淀TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）：TCA10%-20%，蛋白质可冰上沉淀，用丙酮和乙酸清洗沉淀。去除TCA丙酮沉淀：3倍体积的冰丙酮，蛋白在-20度沉淀，离心沉淀蛋白，丙酮通过空气或冻干去除在丙酮中用TCA三氯醋酸沉淀：两者联合使用更有效，10%的TCA在丙酮中重悬裂解样品溶液用苯酚提取，随后在甲醇中醋酸铵沉淀：蛋白质被提取到饱和酚中，在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白，丙酮清洗5聚丙烯酰胺凝胶电泳通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS-PAGE按相对分子质量大小分离蛋白质6聚丙烯酰胺凝胶电泳通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS-PAGE按相对分子质量大小分离蛋白质78等电聚焦电泳9双向电泳10胶上蛋白的检测蛋白质检测常用考马斯亮蓝染色银染负染荧光标记、同位素标记，提高灵敏度和自动化水平11层析分离纯化技术12蛋白质层析分离纯化技术蛋白质薄层层析（硅胶板+层析缸）蛋白质柱层析（葡聚糖、硅胶填料）蛋白质分析制备仪131415161718192021层析分离技术(chromatography)层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法。22凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。三种不同的蛋白质根据它们大小的不同在层析柱中被分离。23亲和层析(affinitychromatography)在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。琼脂糖珠的表面吸附剂(如胰岛素配体)只能同特异的受体结合(胰岛素)24离子交换层析(ion-exchangechromatography)离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法.通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开。图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白。25柱层析分离常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。柱子可以分为：加压，常压，减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长.减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发，以前曾经大量的过减压柱，但是自从尝试了加压后，就很少使用减压柱色谱了。26蛋白质分析制备仪27选择纯化设备纯化需要MicroSpin™Syringe+ÄKTA™系统+PurificationHiTrap™HiTrapModulescolumnscolumns快速，高处理量筛选(GSTor(His)6融合蛋白)非常快速，一步纯化(适合大部分融合蛋白)一步纯化(适合大部分融合蛋白)优化以提高纯度常规实验，重复性好纯化后蛋白复性28HiTrap™Chelating准备柱子用H2O洗加NiSO4再用H2O洗加样用平衡缓冲液冲洗柱子废液收集用洗脱缓冲液洗脱融合蛋白收集组份3min5-15min2min用平衡缓冲液平衡柱子废液3min29高效纯化策略粗提纯化精细纯化载量速度分辩率回收率30准备工作考虑:纯度水平需要量保持生物活性有效和经济蛋白质特性:稳定性-pH-离子强度-温度分子量等电点31pH的重要性:蛋白质净电荷随pH改变滴定曲线蛋白质净电荷1210稳定性范围用阳离子交换用阴离子交换3pH不同pH下的分离情况21+-32pH的重要性:蛋白质净电荷随pH改变流动相的pH选择性VVV阳离子阴离子pH0+-VVVVVAbsAbsAbsAbs表面净电荷AbsAbsAbsAbs33样品准备考虑:根据蛋白质来源选择不同萃取方法使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶在室温以下快速处理用缓冲液维持pH,离子强度目的:稳定样品34三步纯化策略Step纯度粗提中度纯化精细纯化样品准备,萃取,净化达到最高纯度去除大部分杂质分离,浓缩和稳定样品35三步纯化策略步骤粗提精细纯化层析填料的颗粒大小中度纯化36三步纯化策略步骤粗提精细纯化流速中度纯化37三步纯化策略步骤粗提精细纯化分辩率中度纯化38粗提目的纯化粗样快速浓缩(减少体积)和稳定样品(去除蛋白酶)最适用层析技术:离子交换/疏水层析分辩率快速回收率载量39粗提:离子交换填料预装柱20ml颗粒大小流速HiPrep™16/10QXL&SPXL90µm10ml/minHiPrep16/10DEAE&CM90µm10ml/minSepharose™BigBeadsSTREAMLINE™Sepharose™FastFlow40粗提:疏水层析填料高载量高流速HiPrep™16/10Phenyl(高&低取代)HiPrep16/10ButylHiPrep16/10OctylHiTrap™HIC选择试剂盒41中度纯化目的去除大部分杂质最适用层析技术:离子交换/疏水层析HiLoad™离子交换和疏水层析预装柱分辩率快速回收率载量42中度纯化:离子交换填料Sepharose™HP34µmQ&SP150cm/hr小包装和预装柱交联琼脂醣SOURCE™30µmSepharoseHighPerformanceSOURCE30Q&S1800cm/hr聚苯乙烯/二乙烯基苯小包装43中度纯化:疏水层析填料Sepharose™HP34µm苯基300cm/hr小包装和预装柱44回收率载量精细纯化目的达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析分辩率速度45精细纯化:凝胶过滤填料Superdex™PeptideSuperdex200Superdex75Mr3000-70000Mr100-7000Mr10000-600000分离分子量大小(球状蛋白质)102103104105106用prepgrade(34µm)放大HR预装柱(13µm)46精细纯化:凝胶过滤填料Superdex™30pgSuperdex200pgSuperdex75分离分子量大小(球状蛋白质)102103104105106PrepGrade(34µm)有HiLoad™预装柱和小包装填料Mr100-7000Mr3000-70000Mr10000-60000047精细纯化:离子交换填料Mono™BeadsQ&S10µm:MonoQ&S25mg上样载量3µm:MiniQ&SMini™BeadsQ&S2mg上样载量48精细纯化:离子交换和疏水层析填料RESOURCE™15µmQ,S,Phenyl,Ether,Isopropyl1ml预装柱流速高达10ml/minRESOURCEHICTestKit49精细纯化:反相层析填料Sephasil™µRPCSOURCE™RPC硅胶3µmC2/C18聚苯乙烯/二乙烯基苯120Å:肽类C4,C8,C185and12µm硅胶100Å:肽类300Å:蛋白质pH1-12(14)肽类5,15and30µm50Source™30µm15µm5µm离子交换/疏水层析/反相层析反相层析离子交换/反相层析51适用於三步纯化策略的层析技术蛋白质性质层析技术净电荷离子交换(IEX)大小凝胶过滤(GF)疏水性疏水层析(HIC),反相层析(RPC)生物辩识(配基特异性)亲和层析(AC)配基特异性，净电荷,扩张柱床吸附技术(EBA)疏水性有AC,IEXorHIC52适用於三步纯化策略的层析技术层析技术主要特色粗提中度纯化精细纯化IEX高分辨率高载量快速HIC分辨率好载量一般快速AC高分辨率高载量快速GF高分辨率RPC高分辨率53适用於三步纯化策略的层析技术层析技术样品起始状态样品结束状态IEX低离子强度高离子强度或pH改变样品体积不受限制样品被浓缩HIC高离子强度低离子强度样品被浓缩AC特异性结合特异性洗脱条件样品体积不受限制样品被浓缩GF样品体积受限制交换缓冲液(5%总柱体积)流速受限制样品被稀释RPC需要有机溶剂在有机溶剂中，或会损失生物活性样品体积不受限制54纯化工艺中不同层析技术的衔接一般准则:结合互补选择性的技术，纯化工艺应尽量采用不同层析技术(e.g.IEX,HICandGF)减少不同层析技术间的样品处理(e.g.浓缩,交换缓冲液)尽量简单55衔接层析技术时注意事项层析技术结束情况起始条件小量样品GF低离子强度IEX高离子强度或pH改变高离子强度HIC低离子强度特异性结合条件AC特异性洗脱条件样品稀释交换缓冲液(如果需要)56合理衔接不同层析技术低溶解度的蛋白质SDS萃取SDS萃取溶解试剂(尿素,乙二醇非离子性清洁剂)GF(在非离子性清洁剂中)HICHICGFGF57合理衔接不同层析技术粗样或样品含高盐GF脱盐GF脱盐GF脱盐ACIEXHIC或者需要稀释IEXIEXHICGF或RPCGF或RPCGFGF样品澄清粗提中度纯化精细纯化58合理衔接不同层析技术样品非常澄清或很稀ACIEXIEX沉淀(e.g.在高离子强度下)HIC重新溶解GF作含高盐样品处理粗提中度纯化精细纯化GF或RPCGF或RPC59一种不稳定，氧气敏感酶的纯化，结晶和三维结构测定Purificationofalabile,oxygen-sensitiveenzymeforcrystallizationand3Dstructuredetermination一个可溶性，非融合蛋白质的多维纯化去乙酰氧化头孢菌素C合成酶DeacetoxycephalosporinCsynthase(DAOCS)RamaBhikhabhaiandHelenaHedlund,AmershamPharmaciaBiotech联合合作MatthewLloydandChristopherSchofield,OxfordCentreforMolecularSciences,Oxford,UKIngerAndersson,SwedishUniversityofAgriculturalSciences,Uppsala,Sweden60DAOCS去乙酰氧化头孢菌素C合成酶D-AA=d-(D-a-aminoadipoyl)主要参与在头孢菌素和来自链丝菌clavuligerus中青霉素N的头霉菌素的生物合成属于非红血素类亚铁依赖性的氧化酶青霉素NSNCOOHOD-AANHOD-AANHNSCOOHDAOCSRingexpansion去乙酰氧化头孢菌素C61DAOCS-纯化策略纯化目标DAOCS·定性准备样品精细纯化粗提快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)中度纯化快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)62DAOCS-纯化目标得到