质谱数据分析2012

从质谱数据鉴定多肽/蛋白质邵晨►KeyadvantageofproteomicsResearchersworkonthelevelofgeneproductsanddealwithgenesthatarereallyexpressedtogiveadetectablePRODUCTandarenotjustexpressed“whichonlysaystheyproduceadetectablemRNAbutitisnotclearwhetherthereisageneproductornot.►KeylimitationofproteomicsUsually,onlyafractionoftheproteinssynthesizedcanbedetectedinaproteomicsexperiment,whereastheexpressionofALLgenescanbemonitoredinawhole-genomearrayexperiment.►KeyprerequisiteofproteomicsAgenomesequencefortheinvestigatedorganismoratleastacollectionofmanycDNAsequencesisrequired.YogitaMantri&ArvindGopu’spresentation,2003把单个蛋白/多肽从复杂样品中分离出来非常困难，在“组学”实验中一般达不到这个效果MALDIm/zspectrumofapeptidemixtureTheQuadrupoleThequadrupoleconsistsoffourparallelmetalrods.Ionstraveldownthequadropoleinbetweentherods.Onlyionsofacertainm/zwillreachthedetectorforagivenratioofvoltages:otherionshaveunstabletrajectoriesandwillcollidewiththerods.Thisallowsselectionofaparticularion,orscanningbyvaryingthevoltages.sourceVoltageFiltersoutallm/zvaluesexcepttheonesitissettopassObtainsamassspectrumbysweepingacrosstheentiremassrangeCollectsandstoreionsinordertoperformMS-MSanalysesonthem.IonTrapMassAnalyzerTrappedionsIonsinIonsoutThetrapconsistsofatopandabottomelectrodeandaringelectrodearoundthemiddle.Ionsareejectedonthebasisoftheirm/zvalues.Tomonitortheionscomingfromthesource,thetrapcontinuoulsyrepeatsacylcleoffillingthetrapwithionsandscanningtheionsaccordingtotheirm/zvalues.Separatesthemassanalysisandionisolationeventsintime(usingasinglemassanalyzer)Ionizationiontransfer/trappingparentionisolation/fragmentationdaughteriondetectionAmassanalyzerfordeterminingthemass-to-chargeratio(m/z)ofionsbasedonthecyclotronfrequencyoftheionsinafixedmagneticfield.AllionsaredetectedallionsaredetectedsimultaneouslyoversomegivenperiodoftimeIonsareinjectedintoamagneticfield,thatcausesthemtotravelincircularpaths.ExcitationwithoscillatingelectricalfieldincreasestheradiusandenablesafrequencymeasurementFourierTransformMSFouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometry,FTICMSICRcanbeusedwithdifferentionizationmethods,ESI,MALDIAshortsweepoffrequenciesisusedtoexciteallions.Thecomplexspectrumofintensity/timeisanalyzedwithFourierTransformtoextractthem/zcomponetsHighresolutionHighaccuracyVerysensitive(theminimalquantityfordetectionisinorderofseveralhunderedionsNondestructive–theionsdon’thitthedetectionplatesotheycanbeselectedforfurtherfragmentationOrbitrap静电轨道阱质谱傅里叶变换原理MassSpectrometryReviews，Volume27,Issue6讲座大纲►本讲座中，将讲述三种鉴定蛋白质的方法。►1。质量纹鉴定法（PeptideMassFingerprinting）►2。二级质谱的手工鉴定法（DenovoSequencing)。►3。二级质谱的数据库搜索鉴定法（MS/MSDatabaseSearching）。鉴定多肽的流程多肽混合物分离质谱仪一级质谱质量纹选择高峰鉴定多肽质谱仪二级质谱手工鉴定数据库搜索鉴定多肽多肽质量纹鉴定►多肽质量纹（PeptideMassFingerprinting，PMF）是从一级质谱（MS）中鉴定多肽的主要方法。►多肽质量纹一般都用于分析2DE-MS的结果，不适宜分析多个蛋白质的混合物。►其原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽质量的信息。一级质谱图►蛋白质经过酶解后，送入质谱仪，得到一级质谱。►从一级质谱鉴定蛋白质的算法（质量纹）主要用在MALDI-TOF产生的质谱图上。1.目前来说，由MALDI-TOF质谱仪产生的质谱图精度较高。2.另一个问题是，ESI产生的质谱图中的离子通常带有很多电荷，而MALDI质谱图中的离子一般只带一个电荷，比较容易计算。蛋白序列数据库►在网上可以查询到最新的蛋白序列数据库，如IPI，swissprot等等►下载FASTA格式ProteinsequencedatabaseUniprot（包含Swissprot和Tremble）Integr8FASTA格式的数据库►FASTA格式包含蛋白的名称和氨基酸序列。虚拟酶解►有了蛋白序列的信息，我们就可以进行鉴定。►对应于送进质谱仪的样品，首先找到数据库里的序列的酶切位点。质量排列►这样可以产生一系列的多肽，我们可以计算每个多肽的分子量。►最后一个R的质量多加了18，这是因为我们写在下面的是残基的分子量。质量排列►把所有多肽的分子量排序。质量纹►如此，质谱图上的质量就可以与多肽上的质量相匹配。质量纹►这就是多肽质量纹（PMF）的最基础的思路。►但是，真正的将之作为一个鉴定蛋白质的方法，还有很多需要考虑的问题。PMF中的问题►第一个问题：质量相近的多肽怎么处理？►在现实的蛋白数据库中，多肽的数量是很庞大的。这里面难保不会有质量非常相近的多肽。这样，就造成了质谱图上的一个峰可能匹配不止一个多肽，于是我们就难以知晓这张质谱图究竟代表哪个蛋白。质量相近的多肽多肽[M+H+]DGAPLESSSR1019.0490REGESTPSR1019.0520DFPIANGER1019.0940DPLASSSWR1019.0940YVPLKDQR1019.1800HLQLPAPSR1019.1830VLFLNGIDK1019.2200Peakm/z:1019.08解决方案►第一个解决的办法是限制用来搜索的数据库。比如，你如果做的试验用的是小鼠的组织，那么你可以只在小鼠的数据库中搜索，这样就可以减低出现这种情况的可能性。►第二个解决的办法是要求必须有多个多肽和数据库相匹配，才做出最后的蛋白质鉴定。多匹配DFPIANGER1019.09EPISVSSQQMLK1347.56VLDALDSIK974.13CarbonicanhydraseIISHHWGYGKHBGPZHWHKDFPIANGERQSPVNIDTKAVVQDPALKPLALVYGEATSRRMVNNGHSFNVEYDDSQDKAVLKDGPLTGTYRLVQFHFHWGSSBBQGSEHTVDRKKYAAELHLVHWNTKYGDFGTAAQQPDGLAVVGVFLKVGDANPALQKVLDALDSIKTKGKSTDFPNFDPGSLLPNVLDYWTYPGSLTTPPLLESVTWIVLKEPISVSSQQMLKFRTLNFNAEGEPELLMLANWRPAQPLKNRQVRGFPK多匹配可以大大降低随机匹配的概率,从而增加结果的可信度长蛋白和短蛋白►第二个问题：长蛋白可能会更容易的被匹配。►因为长蛋白里的多肽数目较多，以概率来算，匹配上的几率也会比较大。►质量纹算法必须考虑这个问题，给短蛋白一定的补偿。多个蛋白的情况►第三个问题就是在一张质谱图中可能有多个蛋白存在。►通常，MALDI-TOF是与双向电泳连接使用。双向电泳的一个电泳点上可能有2-3个蛋白，这样就增加了鉴定的难度。►由于无法预知一个电泳点上有多少蛋白质，PMF的效果可能会受到很大的影响。多肽质量纹：小结►质量纹算法是用一级质谱鉴定蛋白质的经典方法。►质量纹算法的效果受到很多方面的限制，首先是仪器精度的限制，其次是样品中可能有多个蛋白的限制。这使得质量纹算法不是理想的分析复杂混合物中蛋白成分的方法。►讲座大纲利用二级质谱图►我们刚才谈到了，多肽质量纹有其先天的不足。其中，最糟糕的是它不能处理多个蛋白的混合物。►如果我们能够处理混合物，就可以减少很多用于纯化上的时间和精力。►那么，怎么才能从混合物中鉴定蛋白呢？这就要用到二级质谱。FromNesvizhskii’slectureatISB利用二级质谱图►在一级质谱图中，选择其中的一个峰（母离子），再把这个离子打碎（CID，ECD…），检测碎片离子的m/z，就得到一张二级质谱图。►这里的假设是一级质谱中的一个峰就对应了一个多肽。FromJimmyEng’slectureatISBMolCellProteomics.2011Nov;10(11):R111.009522.利用二级质谱图►对于一张一级质谱图，可以选择多个峰进行二级质谱的操作。这样就可以适应样品里有多个蛋白的情况。鉴定多肽的流程多肽混合物酶解分离质谱仪一级质谱质量纹选择高峰鉴定多肽质谱仪二级质谱手工鉴定数据库搜索鉴定多肽典型二级质谱图CID►CID，即Collision-inducedDissociation，是通过撞击使得多肽的肽键断裂的过程。►在做二级质谱的试验时，质谱仪选择一级质谱中的一个峰，也就是对应质荷比的这些离子，让这些离子高速撞击质谱仪中的惰性气体，使其肽键断裂，这就是CID。FromJimmyEng’slectureatISBa,b,y系列离子最常见幻灯片57b1b2b3y1y2y3LFGKm/zFLGK++FLGK++